解淀粉芽孢杆菌中基因敲除体系的建立

摘要

目的：解淀粉芽孢杆菌在自然环境中广泛分布，易于分离和培养，对人类和人类无毒无害。其代谢物丰富，具有广谱抗菌活性，抗逆性强，生长快，稳定性好，在植物病害的防治中具有多种有益作用，非常适合生物的大规模生产和应用。本研究基于实验室中先前的实验并使用现有的质粒pKSV7，本研究尝试选择合适的反向筛选标记以使无痕基因操作成为可能，并为解淀粉芽孢杆菌C10的遗传修饰提供强大的工具。

方法：相关研究显示，在菌体内体外胸腺嘧啶类似物5-FU可以生成有毒物质5-dUMP，利用这一原理可以敲除解淀粉芽孢杆菌C10内的upp基因，之后获得C10Δupp这一突变菌株，基于这一底盘细胞可以进行自杀型基因敲除载体pKSU-ΔamyA的构建，此载体内含有upp基因，并成功敲除了C10中的amyA基因片段。

结果：

构建的pKSV7-Δupp载体经酶切以及测序确认载体构建成功。在探索解淀粉芽孢杆菌C10的电转化条件后，确定通过LB培养基过夜培养的解淀粉芽孢杆菌 C10在LBS培养基（每升水0.5 M山梨糖醇，10克氯化钠，10克胰蛋白胨和5克酵母提取物）中转接，同时添加0.64%甘氨酸溶液，0.05%Tween 80（w/v）溶液，1.02%DL -苏氨酸溶液，32 ℃振荡培养至 OD600=0.9。重悬感受态细胞时用MSG缓冲液（0.5 M山梨糖醇，0.5 M甘露糖醇和10％甘油）。电转化时预设电压为2000V，电击时间为5ms,电击后加900 uL复苏培养基（LB培养基里加0.5 M山梨醇，0.38M甘露醇），180rpm 32℃复苏3h，涂布含Cm的LB平板。经过对upp基因敲除菌株C10Δupp菌株和原始菌株 C10进行了生长曲线测定，发现upp基因的缺失对菌株生长速率没有影响。以此为依据可以在解淀粉芽孢杆菌的遗传学改造过程中将upp基因作为菌株的反向筛选标记基因。在pKSV7载体中移入upp基因，再一次将含有upp表达盒的反向筛选质粒 pKSU通过接合转移导入解淀粉芽孢杆菌C10Δupp。将重新导入upp基因的突变菌株C10Δupp（pKSU）和突变菌株 C10Δupp在 0.35mM的5-FU的平板上涂布，在此平板上含有upp基因的突变菌株C10Δupp（pKSU）出现生长异常，这表明含有upp基因的菌株对5-FU具有较高的敏感度，这一现象也从侧面表明了在对解淀粉芽孢杆菌进行遗传学改造时，upp基因可以作为一种反向标记基因。构建敲除载体pKSU-ΔamyA，经过电转化进入突变菌株C10Δupp，经过氯霉素与5-FU敏感性检测后，得到突变菌株C10ΔuppΔamyA。同时对突变菌株C10ΔuppΔamyA进行了淀粉酶水解实验。实验结果显示，突变菌株C10ΔuppΔamyA由于α-淀粉酶基因的缺失，不能形成水解圈。实验的成功证实了解淀粉芽孢杆菌C10中基因敲除体系的成功建立，为后续在解淀粉芽孢杆菌C10中的遗传操作奠定了基础。

    关键词：解淀粉芽孢杆菌；载体构建；upp；基因敲除

第一章 前言

1.1 解淀粉芽孢杆菌

芽孢杆菌（Bacillus）在自然界中分布较为广泛，此种细菌的抗菌活性与抗应激能力均较强。在细菌的自然生长代谢中，芽孢杆菌会分泌以挥发性抗菌物质、小分子抗菌脂肽、大分子抗菌蛋白为主的抗菌物[1]。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是日本学者福本（Fukumoto）于1943年首次发现的。由于解淀粉芽孢杆菌的外观和性能特征与枯草芽孢杆菌非常相似，其16SRNA对比同源性高达99％。它最初被列为枯草芽孢杆菌的亚种之一。直到1967年，一些学者利用DNA杂交技术发现解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌是不同的品种[2]。解淀粉芽孢杆菌属于革兰氏阳性杆菌的一种，此细菌为耗氧菌，在自然界有较为广泛的分布，其优点如下：不会对环境造成污染，且不会对动物与人类有损害；分离培养菌株的成功率较高；具有丰富的代谢产物，如大环内酯类、抗菌蛋白、脂肽类等物质，具有良好的抑菌性，可抑制动植物病原菌的生长；代谢产物应用十分广泛等。解淀粉芽孢杆菌代谢产物的主要用途为食物保鲜、动植物细菌病的防治等，因而应用前景十分广泛[3]。表1.1是常见的B. amyloliquefaciens 菌株的应用。

表 1-1 部分报道的 B. amyloliquefaciens 菌株及其应用

Table1-1 Partially reported B. amyloliquefaciens strains and their applications

B.amyloliquefaciens 菌株	应用	参考文献
S76-3	iturin, plipastatin 和 surfactin，用于植物病害防治	Gong et al. 2015[4]
DSM1061	中性植酸酶，饲料添加剂	Xu et al.2015[5]
FZ42	Bacilysin，抗菌物质	Wu et al.2014[6]
LPL061	EPS	Han et al. 2015[6] Huang et al. 2014[7]
HR62	发酵液作为生物有机肥防治番茄枯萎病
LL3	γ-聚谷氨酸	Cao，et al.2011[8]
SD-32	bacillomycin D	Tanaka,etal. 2014[9]
TA208	三唑核苷和鸟苷	Zhang et al. 2011[10]
ATCC 23842	α-淀粉酶	Gangadharanetal.2008[11]
CH86-1	纤溶酶	Lee et al.2010[12]
FZB42	Amylocyclicin	Scholz et al.2014[13]

1.2同源重组

在长久的生物进化与自然选择过程中，不同基因型个体的产生主要依赖于个体内的基因重组及不同个体间的遗传物质交换，之后进行自然选择从而优胜劣汰，人类的进化过程就是好基因与不好基因的长期积累与交换。从这一角度考虑，自然界中的每个个体都是经过基因重组之后产生的。当前人类已知的基因重组技术主要包括以下几种：同源重组、转座重组、非同源重组与位点特异性重组等。其中发生最为广泛的是同源重组，其在所有的生物体中几乎都会发生，是重要的染色体遗传信息交换方式。同源重组的例子主要有：真核生物中姐妹染色单体的基因交换、细菌的转导与重组、细菌与低等真核生物的转化等。这种方式又称一般重组，是受损细胞损伤修复的主要方式。在分子生物学实验中，同源重组技术应用广泛且常用于基因敲除与基因克隆之中。当前主要存在的同源重组分子模型主要有三种：双链断裂修复模型、单链侵入模型与双链侵入模型。

双链侵入模型相关学者在研究真菌基因转化遗传机制的过程中，为对此机制进行解释提出了异源双链交叉结构这一模型，这就是双链侵入模型。通过分子生物学研究显示，此模型中不存在基因复制，在基因重组过程中会形成接头结构。该模型形成的关键是原有的基因链断裂，重新连接之后形成接头结构。这一模型已成为标准，在其他模型中也含有这一接头结构，可作为重组间隙体。然而此模型在个体内具有较低的发生频率，这是由于重组过程的触发必须要求在同一位置、同时切断两个基因分子。单链侵入模型

1975年Meselson与Radding构建了单链入侵模型，此模型的构建是以Holliday模型为基础，对其进行修改与添加之后形成单链入侵模型。对此模型的解释是在两个DNA分子中，在随机位点切割一个DNA分子的一条单链，此单链暴露出的末端对另一个分子进行入侵，找到与之相互补的序列之后两者结合，将原来的DNA链替换下来。之后以剩余的链为模板，利用DNA聚合酶对缺口进行填补。之前被替换下的DNA链降解消失，其剩余末端连接到另一个分子中新合成的基因链上，这就是霍利迪接头的形成过程。霍利迪接头形成之后马上被异构化，之后被拆分为几个部分。因而这一模型中的双链是不对称的。

　三、双链断裂修复模型

Szostak于1983年研究酿造发酵时，提出了以基因重组为基础的双链断裂修复模型。对这一模型的主要解释为：首先在核酸内切酶或其他因素的作用下参与重组的DNA双链发生断裂，在核酸内切酶的作用下，核酸外切酶进行扩展形成缺口并促进3’单链粘性末端的生成。其中一个3’末端对另一个进行入侵，双链DNA中的同源区域对供体双链DNA的一条单链进行取代，因此形成了单链双链DNA与D环。以3’端为引物，以未拆散的单链DNA作为模板进行基因的修复与复制，在DNA聚合酶的作用下形成了Holliday连接子共两个。最后与前两中模型类似的是，这两个Holliday连接器被拆分为多个部分。总结来说，无论是真核生物还是原核生物，其基因重组主要为以上三种模型。上述三种模型之间的关系为相互联系与补充，且更多研究显示，最常见的重组方式为在双链断裂的情况下引起的同源重组。

1.2.1 RecA重组系统

RecA重组系统的主要组成部分为RecA蛋白与RecBCD复合蛋白，属于大肠杆菌自带的非外源同源重组系统。RecA蛋白具有的特征主要包括单链DNA结合活性与DNA依赖的ATPase活性，前者表示RecA蛋白可以与大量单链DNA结合在一起，每个RecA单体平均可以结合的核苷酸数量为4个，此为耗能过程；后者表示RecA蛋白可以作为ATP酶将ATP水解，产生能量，在存在DNA的环境中促进基因链的交换。在重组过程中，RecA蛋白的作用十分重要。在体外条件下，RecA蛋白可以对同源DNA分子间的配对、缔合、分支迁移与链交换的过程起到促进作用。相关研究发现，以RecA蛋白为催化条件的链交换与同源配对过程可分为三个时期：

预结合，首先在RecBCD酶的作用下，单链DNA形成3’端突出。RecA蛋白积聚在这一DNA单链上，这就是核酸蛋白丝状复合物的形成过程；结合，预结合形成的核酸蛋白丝状复合物中，RecA蛋白寻找同源双链DNA用以使之与单链DNA之间进行垂直配对，这就是RecA单链DNA复合体三元的形成过程；链交换，单链DNA对双链DNA进行入侵，在进行同源配对之后将其同源部分取代。之后单链DNA与互补链形成配对碱基，这就是D环的形成过程。RecBCD这一蛋白质十分复杂，RecBCD酶属于核酸外切酶的一种，其具有单链/双链核酸外切酶活性与线性解旋酶活性。后者主要是指RecBCD酶可以利用水解产生的能量解旋线性双链。复杂蛋白对同源重组过程的促进作用主要为：蛋白首先结合于双链缺口上，解链之后在这一位点产生DNA单链。同时由于RecBCD酶属于核酸外切酶的一种，因而在细菌中可以降解线性分子。其必须以环状质粒靶向载体为媒介才可利用微生物本身的RecA重组系统。本文中1.4节主要描述了这一应用策略。

　1.2.2Red同源重组

尽管Red同源重组系统是以传统同源重组技术为基础进行改善之后形成的，但是此方式依然存在缺点：首先这种方式对同源臂的要求更高，需要其靶基因达到一定的长度；其次应用Dicer酶的前提是必须构建环状质粒，这样就会增加实验成本、工作量及实验操作的复杂程度，但是其重组效率依然无法提高。在对重组体进行筛选时，需要耗费大量人力物力。近年来，以线性DNA为介导的同源重组技术十分热门，该技术在进行基因操作，如基因敲除、片段修饰、基因取代、缺失、插入时使用的同源臂为大体一致的左右两臂。相比于传统特定位点消化法来说，这一方法可以避免一些基因操作过程，如质粒的构建、消化与连接等，这样就使得基因操作更加简便快捷，有利于人工成本与时间成本的节约。在重组过程中可以选择目标片段为以PCR或直接合成得到的线性DNA片段，在目标细胞中将片段转化进去，从而诱导重组细胞的蛋白质表达过程。

对大肠杆菌染色体中Red同源重组系统利用的首次报道出现在1998年。Murphy第一次通过研究发现，P. utilis的Red同源重组功能可以取代大肠杆菌中本身携带的同源重组功能。在之后十年的研究中，研究的热门逐渐转向以λ细菌为基础的Red同源重组系统，之后这一技术被广泛应用于同类基因工程菌的遗传修饰中。

Exo、bet和gam共同组成了噬菌体λRed重组系统。Exo蛋白是exo基因的产物，该基因可以5’末端对双链DNA进行降解，形成3’突出末端，因此，在5′-3’的方向，其具备核酸外切酶活性。环状三聚体是Exo蛋白的活性形式。在Exo蛋白的内部，其一端容纳单链DNA分子，另一端容纳双链DNA分子，在其内部这三个单体分子相互连接形成通道，这是一个结构决定功能的典型例子。beta产物即单链结合蛋白由bet基因产生，分子量达到28KD。要想形成新的双链片段，单链结合蛋白可以与单链相结合，从而使互补链退火。具有与特性的重组蛋白还有以下几种：真核Rad52蛋白（大肠杆菌Rac噬菌体）、RecT蛋白（大肠杆菌Rac噬菌体）、Erf蛋白（沙门氏菌P22噬菌体），这些蛋白都可以使互补单链DNA退火。线性DNA的重组过程由Exo蛋白和Beta蛋白来完成。Gam蛋白是gam基因的产物，其分子量为16KD。在大肠杆菌中，该蛋白可以避免线性DNA片段被降解，并且可以使RecBCD蛋白复合物的核酸外切酶活性受到抑制。

1.3解淀粉芽孢杆菌的转化方法

枯草芽孢杆菌目前有五种将外源DNA引入枯草芽孢杆菌的转化方法，例如噬菌体转导[14]，原生质体[15]，自然转化[16]，重组方法[17]和电穿孔[18]。前两种方法是将DNA引入芽孢杆菌的重要方法[19]。

　1.3.1 原生质体转化法

在对芽孢杆菌进行外源质粒转化过程中，其最大的阻碍是较厚的细胞壁会阻碍质粒的进入。原生质体转化法的原理是用溶菌酶提前处理菌体，溶解其细胞壁后形成原生质体，这样导入外源质粒就会更加方便，成功导入之后将其转移至再生培养基中重新恢复细胞壁。这一方法较为传统，Chang 和 Cohen在研究中使用了枯草芽孢杆菌原生质体转化法，以此为参考可以在芽孢杆菌原生质体转化的过程中调配所需的培养基与缓冲液。同时这一方法也是多种芽孢杆菌进行外源质粒转化的重要方式 [15]。

　1.3.2自然转化法

自然转化法的主要依据是菌体具有的能力为可形成天然感受态，可以将外源DNA重组进入基因组中。B.subtilis DNA 转化方法是由Spizizen所发明的经典方式[16]。然而这一方法的应用率较低，这是由于其具有很低的转化效率。以此为基础李瑞芳改进了这一转化方法，有利于菌体形成感受态，但是对转化效率的提高并无帮助。

　1.3.3电转化法

当前电转化法在实验中应用较为广泛，这是由于其具有转化效率高、操作简便、适用菌种范围广泛、周期较短等优点。在长期的研究过程中，针对不同的菌株研究出参数不同的电转化法。Xue等在地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的外源质粒转化实验中就是运用的电转化法[18]。然而在实际操作中，其主要障碍是对转化条件的要求十分苛刻，因此下一步必须探讨研究对电转化法中参数的调节。

但是，由于繁重的工作量和耗时的实验过程，这两种方法并未得到广泛使用[20]。通常使用自然转化和重组方法将DNA引入枯草芽孢杆菌，结果是某些枯草芽孢杆菌的转化效率很高[16,17]。但是，这两种方法的转化效率与某些基因密切相关，例如群体感应组件和能力主调节子comK。这些基因的不同结构导致转化效率的巨大差异[21,22]。因此，天然转化和重组方法在菌株中具有特异性。与其他方法相比，电穿孔是一种常见的省时的转化方法，已被广泛用于枯草芽孢杆菌[18-20,23,24]。尽管枯草芽孢杆菌的电穿孔方法已经研究了很多年，但对于所有枯草芽孢杆菌仍没有标准和通用的方案。

由于解淀粉芽孢杆菌的巨大工业价值，对于基因操作的各种方法，研究人员也提出了更高的要求。当前非常多的菌株已有全基因组测序结果被发表，因而出现了越来越多的位点可用于基因操作，在这种情况下，为加快菌株转化的效率，必要的是简便高效的基因操作方法。不幸的是，解淀粉芽孢杆菌的遗传操作通常限于转化步骤。与其近亲枯草芽孢杆菌相比，解淀粉芽孢杆菌菌株在转化方法上具有更大的缺点：首先，解淀粉芽孢杆菌不能形成天然的感受态，不可以用诸如枯草芽孢杆菌的PCR片段转化；其次，一些解淀粉芽孢杆菌菌株转化效率低，甚至不能完全转化[25]。所报道的解淀粉芽孢杆菌菌株的大多数转化都需要电穿孔。通常，将山梨糖醇或蔗糖添加到培养基中以增加渗透压，或者甘氨酸或丝氨酸可以削弱细胞壁以增加转化效率[25,26]。 Zakataeva等发表了通过噬菌体转导来完成解淀粉芽孢杆菌的转化[27]。然而对于普通实验室而言，这种操作方法所需的材料获得十分困难，而且具有复杂的操作过程，因而不是十分适用。因此，研究淀粉芽孢杆菌转化方法具有重要的理论意义和应用价值。

1.4 芽孢杆菌属中的遗传操作策略

不管是大规模的染色体遗传工程，还是单基因敲除实验，简便有效的遗传操作是必须的。如何将敲除的DNA元件如何转化成受体细菌，有以下几种适用于芽孢杆菌属的基因操作方法。

　1.4.1. 利用自杀质粒进行基因敲除

在宿主细菌中，无法进行复制的质粒就叫做自杀质粒。在运输DNA元素的过程中，这一质粒应用十分广泛[28]。图1-1表明了基因敲除的过程。在进行基因敲除时，自杀质粒与同源臂连接到一起，之后在宿主菌株进行转化。在宿主菌株中自杀质粒不能进入自主复制过程，因而当发生细胞分裂时，新复制的细胞中就会失去自杀质粒，这样在进行抗生素平板筛选时这些转化体就会被筛选出去。留下来的转化体都具有抗生素抗性，这些转化体的形成是在RecA介导下，染色体上相应的同源序列与同源臂之间发生同源重组，之后这些质粒就会整合于细胞染色体中，在之后的细胞分裂中也不会丢失，因而具有抗性。在经过抗生素筛选之后留下来的菌株就是第一次同源重组之后形成的转化体。在此转化体内染色体中存在同源臂两组，其中之一可以发生第二次分子内同源重组，之后将质粒从染色体上分离出来，再对染色体进行检测，其主要表现出两种结果：第一种是染色体恢复了野生型，另一种是用已构建的同源臂替换原始序列。二者可以通过PCR进行区分。

在大多数芽孢杆菌菌株的报道中，图1.5中的C是特定的抗生素抗性标记。若被敲除的基因数量较少甚至只有一个，菌株的抗生素抗性标记就可以迅速构建突变菌株。若不将抗性标记用于菌株，则很少会发生第二次同源重组，这样就必须使用反向筛选标记。

图1-1利用自杀质粒进行基因敲除图示

Table 1-1 Gene knockout using suicide plasmid

　1.4.2 利用条件自杀型质粒进行基因敲除

这种质粒有两种常见的类型。一种是具有温度敏感性复制起始位点的温度敏感型质粒[29]。另一种是无法进行自主复制，但能借助其它质粒完成复制过程的质粒[30]。自杀质粒的形成原因有两种：培养温度发生变化或者辅助质粒被消除。近年来，该质粒以低转化效率，被用于部分菌株，参与基因敲除过程。对于温度敏感型质粒来说，要进行基因敲除，首先要有适合质粒复制、培养并富集的温度，并在此条件下获得转化体，为完成基因同源重组提供充足的碱基。然后改变培养温度，让质粒无法自主复制，只能通过基因同源重组，将质粒整合到其它辅助质粒上，以获得抗生素抗性，从而存活下来。之后在对应的抗生素平板上完成筛选过程并获得单次交换菌株，后续筛选流程同自杀质粒。

1.4.3 基于线性DNA片段进行基因敲除

随着功能基因组学的快速发展，基因敲除成为开展基因功能研究的重要内容。目前，基于线性DNA片段的基因敲除方法最适合用于大量基因组转化，它不需要耗时的载体构建流程。以下是枯草芽孢杆菌进行基因敲除的一般过程。首先通过PCR制备线性DNA片段，该片段的组成结构包括末端的同源臂以及同源臂中间的抗性筛选标记。然后将获得的DNA元件转化进待进行基因敲除的菌株，末端的两组同源臂经两次重组被融入到染色体中，从而替换需敲除的序列。为去除染色体上标记的抗生素抗性，学者们研究出两种方法：一是于体外建立仅包含同源臂而没有抗性标记的DNA元件，该元件必须包含合适的反向筛选标记基因；二是对抗性基因进行两次重组替换，即在DNA元件的反向筛选标记的两端，加入重复或具特异性的DNA序列，并通过基因同源重组或位点特异性重组除去染色体上的抗性标记。这种基因敲除方法适合于具有天然能力的菌株，例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[31]。在大肠杆菌中，RecBCD复合物的核酸外切酶活性可迅速切割导入细胞的线性片段。但是，可以通过引入噬菌体编码的重组酶来克服这种不稳定性。例如，大肠杆菌中λ噬菌体的red和gam基因能有效避免因温度、湿度或其它原因造成的DNA大分子链断裂或化学结构改变，同时，还有利于发生同源重组。研究表明，40-60 bp的同源臂有助于基因敲除试验的进行[32]。

　1.4.4 无痕基因操作方法

基因敲除过程中，由于抗生素抗性标记的存在，可能会存在一些负面影响，相关研究表明，无痕基因操作方法能有效降低重组菌株对抗性筛选标记的携带率，是目前研究特异基因型生物的有效手段。

基于线性DNA片段的基因敲除方法，通过一次同源重组替换目的基因后，使DNA元件整合到染色体中以取代靶基因，为去除抗性标记，需要再进行第二次同源重组。一般情况下，发生同源替换的可能性不高，而且离开适当的抗性标记或辅助质粒的帮助，重组菌株很难筛选成功，甚至不可能。在利用自杀质粒进行基因敲除时也出现类似情况，这种质粒不能进行自主复制，必须借助于染色体上的其它辅助质粒才能完成，自杀质粒需要经过两次同源重组替换，才能除去染色体上的抗性标记物以及质粒。在对Bacillus subtilis的研究中，研究者采用了无痕基因操作技术，并取得很大成效。虽然有所区别，但两种方法都是为了提高筛选重组菌株的可能性。

2002年，Fabret等人报告了由枯草芽孢杆菌PCR转导的无标记基因操作技术。作者用upp进行反向筛选标记，来对尿嘧啶磷酸转移酶进行编码（UPRTase）[31]。要完成反向筛选，第一步是在培养基中加入5-氟尿嘧啶（5-FU），该物质在URRTase的作用下形成5-F-UMP，再通过生物代谢作用转化为5-F-dUMP。 5-F-dUMP能起到抑制细胞生长的作用。二是需要利用反向筛选基因，消灭菌株的活性。除需要两组同源臂、DNA元件、抗性标记以及反向筛选标记外，还需引入两个正向重复（DR）于上下同源臂内。利用同源臂将DNA元件融合进菌株中，通过第一次重组，使菌株获得抗生素抗性，并确保染色体上存在upp，增加菌株对5-氟尿嘧啶的敏感性。为完成基因敲除，还要对获得的两个同源重组菌株进行筛选，让抗性物被标记，upp表达盒和多余的DR从染色体上脱落。 DR是最初存在于染色体上的序列，因此所得的突变体不会像位点特异性重组一样在染色体上留下外来序列。这也是第一个报告upp在芽孢杆菌中的使用的研究。尽管这种线性片段转化方法不适用于其他物种，包括解淀粉芽孢杆菌，但是upp反向筛选标记已被广泛使用[32,33]。2006年，Zhang等人在枯草芽孢杆菌中引入了另一种类型的反向筛选标记毒性蛋白[35]。研究表明，大肠杆菌的mazF基因促进RNA干扰酶的表达，这种内源RNA的过表达激活细胞程序性死亡[36]。作者以mazF基因进行反向标记，引入的线性片段包含两组同源臂、两个正向重复序列以及标记基因三部分。首先通过两组同源臂将整个元件整合到染色体上。然后相邻DR序列间发生第二次重组，从而去除抗性标记。将IPTG表达mazF添加至筛选培养基以抑制未经历第二同源重组的菌株。Moeimoto等继续使用mazF为反向筛选标记基因，但用到的DNA元件结构有所差异[106]。Yu（2010）等的研究与前人不同，他对线性元件中缺乏IPTG诱导型启动子的严格性进行了研究[37]。这些研究说明，大肠杆菌的载体构建受Pxyl、maz F等基因的影响，而且，upp的使用频次高于mazF。Liu等研究出一种新型无标记基因敲除方法，该方法中用到的反向筛选标记基因为木糖启动子与抗生素抗性基因的结合体（2008）[38]，所获得的菌种具有新霉素抗性，上游同源臂的片段是UP、下游是DN，上下同源臂之间是G，同时还有araR和氯霉素抗性基因。具体操作方法如下：首先使上下同源臂之间发生同源重组，形成DNA元件与染色体的结合体，因为araR的存在，此时新霉素已经没有抗性。在基因敲除过程中，两个同源臂由于具有同源区域，存在发生基因重组的可能性，一旦发生同源重组，DNA元件就会脱离染色体，从而实现基因的无痕消除。在这种状况下，要保持新霉素的抗性，可以用新霉素作为筛选基。

Yan等在2008年将Cre / lox应用于枯草芽孢杆菌[39]。 Cre / lox最先由Sternberg等人提出，并被广泛用于新型基因打靶，属于特异性重组酶的一种，它以较高的重组效率，被广泛用于基因工程[40]。重组酶Cre可以在不借助其它辅助因子或蛋白质的情况下，使该重组酶系统的两个loxP位点发生特异性重组，随着基因重组的发生，两个正向重复loxP位点之间的DNA序列可能会缺失，而反向重复的双位点间的DNA序列可能反向。当应用于基因敲除时，loxP位点保留在最终突变体中。因此，当将突变连续引入同一菌株中时，两条染色体上剩下的loxP位点之间可能发生意外的重组。所以，作者在开展研究时，引入lox位点的两个突变位点，lox71和lox66，二者形成一个双突变的lox位点lox72，这是Cre无法识别的，从而避免了由意外重组引起的染色体结构变化。 通过PCR在体外构建用于敲除的DNA元件，包括上游和下游同源臂，抗性标记，lox71以及lox66位点。在诱导该片段转变为宿主细菌，并用相应的抗生素进行筛选后，该染色体上融入lox71以及lox66两个突变位点。然后，用辅助质粒pTSC催化Cre重组酶的表达，从而促进同源重组的发生，并完成抗生素敏感菌株的筛选，最后，通过改变温度消除辅助质粒。

Shi等在对枯草芽孢杆菌的研究中，引入了I-Sce I核酸内切酶，并通过在染色体上整入外源dsDNA，促进双链断裂的表达[42]，另外，作者还利用upp基因提高筛选效率。因为线性片段投入到枯草芽孢杆菌的研究中也是可行的。综上所述，基于线性片段的非标记敲除方法在基因组缩小中得到广泛使用。就目前来看，解淀粉芽孢杆菌还缺乏线性断裂方法的使用。 Zakataeva等[27]研究出一种基因无痕敲除方法，该方法主要针对温度敏感型质粒，即可在解淀粉芽孢杆菌菌株中进行无痕操作，而无需反向筛选标记。作者使用了一种源自pG +的温度敏感质粒，该质粒与解淀粉芽孢杆菌菌株中的染色体分离，效率接近100％。但是，本研究发现，使用pKSV7这种温度敏感质粒进行基因敲除，质粒脱离染色体的概率比较低，约0.3％。即使在基因敲除或插入中进行抗性标记，在筛选目标突变菌株之前，仍然有必要筛选200个以上的菌落。造成这些差异的原因可能是本研究使用的质粒不同。因此，在实验过程中，应该针对性的选择反向筛选标记基因，从而完成解淀粉芽孢杆菌LL3中的基因敲除或基因组减少工作，同时，为其他解淀粉芽孢杆菌菌株的标记基因选择上提供理论借鉴。

　　1.5 表达载体构建原件

在试验的过程中，选取信号肽一般要遵循与宿主同源性高的，因为质粒表达时，在分泌表达中信号肽和分泌信号有着不可或缺的作用。完整的表达载体主要含有以下方面的内容：信号肽、启动子、筛选信号、终止子、分泌信号、复制起始位点、基因克隆位点。应用启动子片段的过程中，通常会选取宿主菌自身的启动子，或者与宿主菌染色体同源性高的。在进行外源表达分析时，最好选择自身的启动子和信号肽，或者与宿主菌具有加大同源性。有研究者发现，通过利用B.licheniformis的自身启动子Pamyl，可以实现在地衣芽孢杆菌体内，高效表达α-淀粉酶基因（牛丹丹等）。还有研究者表明，在枯草芽孢杆菌（WB800 ）中实现了bgaB基因的高效表达，枯草芽孢杆菌与bgaB基因的启动子具有较高的同源性（傅晓燕等）。还有一些研究者，利用枯草芽孢杆菌的PR、P1、P43等自身启动子，在枯草芽孢杆菌中，使得不同外源基因的不同表达形式得到实现。为获得更高的表达率和转化率，在进行表达载体构建的过程中，对枯草芽孢杆菌自身的启动子进行优先选择。

目前，芽孢杆菌表达载体系统的构建已经相对比较成熟，但是研究芽孢杆菌载体构建的过程在不断的进行修正改善，因为仍然存在一些不足，也有一些失败的例子存在。下文主要讲述在宿主菌构建表达载体的过程中，芽孢杆菌所出现的问题，以及对其的相应解决措施。 以下是芽孢杆菌作为宿主菌出现的问题：

1.菌体因素：表达载体不同，其宿主菌也要不同，即菌体不同，外源基因也要不同，这是因为芽孢杆菌能够分泌蛋白酶。此外，在基因工程改造方面，以野生菌作为宿主菌还是不能顺利完成。

2.质粒载体：质粒载体是外源基因表达的中介，在宿主菌中，质粒载体可以进行稳定遗传，只有提高质粒的拷贝数，才能使外源蛋白基因的表达量得到保证，但是，蛋白表达量与质粒的拷贝数不成正比。

3.转化方法：在表达载体构建时，转化效果被转化参数制约，模式菌株的参数不能够符合野生菌株载体的要求，因此，应该进行不断的试验找到最佳转化方法。

　1.6研究目的及意义

1.6.1 建立解淀粉芽孢杆菌C10中的无缝基因操作方法

在本实验中，对本实验室持有的解淀粉芽孢杆菌C10菌株来说，即使在使用抗性标记的情况下，也不能仅使用温度敏感性质粒pKSV7有效地进行基因敲除或插入等遗传操作。基于实验室中的实验（先前的），并使用现有的质粒pKSV7，为使无痕基因操作成功，需要选择合适的反向筛选标记，并为解淀粉芽孢杆菌C10的遗传修饰提供强大的工具。

　1.6.2 建立解淀粉芽孢杆菌C10中的电转化参数

将外源DNA转化至解淀粉芽孢杆菌C10中，由于解淀粉芽孢杆菌的细胞壁较厚，将会严重阻碍外源质粒通过电击造成的极小孔洞，此外，在表达载体构建时，转化效果被转化参数制约，模式菌株的参数不能够符合野生菌株载体的要求，因此，在培养C10的生长培养基，感受态培养过程中菌液的OD600值、细胞壁弱化剂的选择、浓度、时间，电穿孔缓冲液，电击时电强强度、电击时长、复苏培养基、复苏时长进行不断的尝试，进行优化。

　1.7本课题研究路线

     第二章 pKSV7-Δupp载体的构建

　2.1实验材料

　　2.1.1 菌株及质粒

解淀粉芽孢杆菌C10，温度敏感型质粒 pKSV7。质粒图谱如图2-1。

图2-1 温度敏感型质粒 pKSV7。质粒具有一个芽孢杆菌的温度敏感型复制子和大肠杆菌复制子 ColE1 ，使其能够穿梭在芽孢杆菌和大肠杆菌之间，芽孢杆菌中，呈现的是温度敏感型复制。cat即氯霉素抗性基因，bla即氨苄抗性基因。MCS即多克隆位点，顺序按照从上到下，有 HindIII，SphI，PstI, Sal I, XbaI, BamHI, Sma I, KpnI, SstI, Eco RI。

Figure 2-1 Temperature-sensitive plasmid Temperature-sensitive plasmid pKSV7. The plasmid has E. coli repliconColE1 and a temperature-sensitive replicon of Bacillus, which enables it to shuttle between E. coliand Bacillus and present temperature-sensitive replication in Bacillus. bla, an ampicillin resistance gene. cat, chloramphenicol resistance gene. The multiple cloning sites (MCS, in order from top to bottom) are HindIII, Sph I, PstI, Sal I, XbaI, Bam HI, SmaI, KpnI, Sst I, Eco RI.

　2.1.2实验试剂

Taq DNA 聚合酶、溶菌酶、DNA Marker III、DNA Marker 1kb、pMD19-T simple、T4 DNA ligase、Bam HI 甲基转移酶、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、FastDigest BamHI、 FastDigestSalI、FastDigest XbaI、FastDigestKpn I、 FastDigest Eco RI、琼脂糖、溴化乙锭、EDTA、冰醋酸、氯化钠、酵母提取物琼脂粉、细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA 片段回收试剂盒、可溶性淀粉、山梨醇、聚乙二醇 6000、甘露醇、Tris、琼脂粉、蔗糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钙、0.2 µm纤维滤膜。

2.1.3 引物序列

表2-1 本节所用引物及序列

Table 2-1 Primers and sequences used in this section

引物名称 引物序列

UppUP-FCAGCGAATTCACGTCATCTCGAACGCGAAG UppUP-R GACCCGGAACGATCATACTGTGTTCAGCTCC UppDN-FTGAACACAGTATGATCGTTCCGGGTCTCGGTG UppDN-RGCGCGGTACCCACAAATACATATCTCCGTTG UppOUT-F GAGGACATCGCCCGCGACC UppOUT-RGACAAAATCAACAATCCATTCCATG

　2.1.4培养基及溶液

　　2.1.4.1 培养基和缓冲液

LB培养基：将10g的氯化钠、10g胰蛋白胨、5g的酵母提取物加入到950 ml的去离子水中，将混合液进行充分摇动，直到溶质完全溶解。将pH至7.0，可以使用NaOH5mol/L进行调节。然后使用离子水将溶液定容至1L。将1.5%-2.5%琼脂粉加入到固体培养基中，使用高压蒸汽对溶液进行灭菌。

电泳缓冲液（50×TAE）：将Na2EDTA·2H2O 37.2 g 和Tris242.0 g 加入到80000 mL的去离子水中，将其进行均匀搅拌，然后加入冰乙酸57.1 mL ，溶解充分后，使用去离子水将溶液定容至1 L，最后在室温的条件下进行保存。

　2.1.4.2 抗生素母液及工作浓度

氨苄（Amp）：在1 mL ddH2O中，将氨苄 100 mg 溶解在其中，溶解后对其进行过滤除菌，过滤过程可以使用0.2 µm纤维滤膜，在温度为-20℃的条件下对母液进行避光保存。100 µg/mL为其工作浓度。

氯霉素（Cm）：在无水乙醇中，取氯霉素称34 mg 溶解于其中，然后在温度为-20℃的避光条件下进行保存。其中5 µg/mL为工作浓度。

　2.1.5实验设备

表2-2 仪器名称及生产厂家

Table 2-2 The instrument name and manufacturer

仪器名称	生产厂家
电子分析天平	上海西艾爱电子有限公司
高压蒸汽灭菌锅	江阴滨江医疗设备厂
低温离心机	Eppendorf
加热制冷型金属浴	卡尤迪生物科技
烘干箱	上海精宏实验设备有限公司
电泳仪	北京市六一仪器厂
WFH-201B紫外透射反射仪	上海精科实业有限公司
电热恒温振荡水槽	上海精宏实验设备有限公司
台式高速大容量离心机	Eppendorf
大容量恒温培养振荡器（摇床）	上海智城分析仪器制造有限公司
恒温培养箱	上海精宏实验设备有限公司
超净工作台	苏州净化设备有限公司
PCR仪	Eppendorf

　2.2 试验方法

　　2.2.1 菌株活化

在严格进行无菌操作的条件下，用接种环挑取-80℃保存的菌株解淀粉芽孢杆菌 C10，在 LB 固体培养基平板上接种划线，放入32℃条件下过夜倒置培养，E. coliDH5α、E. coliJM110在LB平板上划线，于37℃条件下过夜倒置培养。

　2.2.2确定解淀粉芽孢杆菌C10对5-氟尿嘧啶（5-FU）耐受浓度

首先制备5-FU平板，即不同浓度5-FU的LB琼脂平板，终浓度分别为0.1 mM，0.15 mM，0.2 mM, 0.25 mM, 0.3 mM, 0.35 mM, 0.4 mM。将在平板上划线活化得到解淀粉芽孢杆菌 C10菌株，用接种环挑取单菌落置于 LB 液体培养基中，180rpm，32°C过夜培养，在无菌台内操作将其稀释10-7到10-9倍，在5-FU 平板上（特定浓度），将100µl的稀释物涂布在上面。在温度为32°C的情况下，对其进行过夜培养，对每个平板上的菌落数进行观察。

　2.2.3 解淀粉芽孢杆菌 C10菌株基因组的提取

基于天根细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤如下：

取5mL过夜培养菌液，4℃12000rpm 离心2min，除去上清，以上步骤重复一次，共3mL菌液。

2.加入567µl 的TE缓冲液，充分混匀，加10％SDS30µl 和20mg/mL蛋白酶K 15µl ，37℃温育1h。

3.加100µl 的5mol/L NaCl，吸打混匀，加CTAB/NaCl 溶液80µl混匀，出现絮状物，65℃温育10min,此时溶液变清亮，絮状物消失。

4.加入等体积（500µl）氯仿/异戊醇（24:1）混匀，4℃12000rpm 5min,上清转入新管。

5.加等体积（500µl）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，4℃12000rpm 5min,上清转入新管。

6.加0.67倍体积的异戊醇（500µl），轻轻混匀（此时不可剧烈震荡，可能引起DNA断裂）至产生DNA沉淀，4℃12000rpm 5min，倒掉异丙醇，加入70％乙醇1mL。

7. 接上一步4℃12000rpm 5min，用移液枪吸取去除乙醇，离心30s，无菌风下吹10min，悬空滴加30-50µl TE缓冲液进行溶解。在室温条件下放置 2 min，以12 000 rpm的离心速度进行离心2 min。

8. 基因组DNA就是离心管中收集到的液体，其检测使用1％的琼脂糖凝胶电泳。

　　2.2.4 upp上下游基因扩增及连接反应

　　2.2.4.1upp上下游基因扩增

用DN-F 表示upp下游同源臂扩增的正向引物，DN-R表示反向引物用；使用UP-F表示upp上游同源臂扩增的正向引物，UP-R表示反向引物使用。首先，DN和UP 是要融合的两个片段，两者进行分别扩增,下表是PCR的反应体系。

添加物	用量
C10基因组DNA	2µl
UP-F	1µl
UP-R	1µl
dNTPs	4µl
10×Buffer	5µl
Pfu	1µl
ddH2O	36µl
总计	50µl

添加物	用量
C10基因组DNA	2µl
DN-F	1µl
DN-R	1µl
dNTPs	4µl
10×Buffer	5µl
Pfu	1µl
ddH2O	36µl
总计	50µl

扩增upp上游同源臂循环体系如下：

94℃	3min
94℃	30s
63℃	30s
72℃	2min
72℃	10min
4℃	∞

扩增upp下游同源臂循环体系如下：

94℃	3min
94℃	30s
61℃	30s
72℃	2min
72℃	10min
4℃	∞

将获得的上、下游同源臂进行切胶回收，得到纯化的UP 和DN，按照如下体系进行融合反应：

添加物	用量
UP、DN	各2µl
UP-F	1µl
DN-R	1µl
dNTPs	2µl
10×Buffer	5µl
Pfu	1µl
ddH2O	36µl
总计	50µl

循环体系如下：

94℃	3min
94℃	30s
63℃	30s
72℃	2min
72℃	10min
4℃	∞

由于用Pfu酶PCR的产物为平末端，需要再用Taq酶PCR，在产物末端添加一个A，方便与T载体连接。所以用Pfu酶PCR的产物为模板，再用Taq酶进行PCR。

循环体系同上。

　　2.2.4.2DNA片段的回收

DNA 片段的回收可以使用Axygen 凝胶回收试剂盒，具体步骤如下：

1.在EP 管中，加入琼脂糖凝胶条带（含目的 DNA），该条带是在紫外灯下进行切割而成，把无 DNA 的区域去除，保证凝胶重量在150 mg以内，最后称取重量。

2.将等体积的溶液PN装入的EP 管中（有凝胶），在温度为50℃的条件下进行金属浴，期间混合数次，直至胶块完全溶解。

3.在收集管中放入吸附柱，在吸附柱中加入平衡液BL500µl，以12000 rpm的离心速度对其进行1min的离心，将收集管中的废液倒掉，最后将吸附柱放入收集管中。

4.在吸附柱CA2中加入完全溶解的胶块溶液，在室温的条件下，对其静置2 min，以12000rpm的离心速度对其进行60s的离心，倒掉废液，把吸附柱CA2放入收集管中。

5.将600µl的漂洗液PW加入到吸附柱CA2中，以12000 rpm的离心速度对其进行60s的离心，去掉废液，将吸附柱放入收集管。

6.对操作步骤5进行重复操作。

7.在收集管中放入吸附柱CA2，以12000rpm的离心速度对其进行2min的离心，除去漂洗液，在室温条件下，保存吸附柱CA25 min，将其进行彻底地晾干（因为残留的漂洗液会对下面PCR和酶切等反应造成影响）。

8.在干净的离心管中，放入吸附柱CA2，悬空滴加50µl的洗脱缓冲液EB到吸附膜圆片中，在室温条件下，将其静置2 min，以12000rpm的离心速度对其进行2min的离心。对回收DNA浓度进行测定，并利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

　2.2.4.3制备E. coliDH5α、E. coliJM110感受态

1.将E. coliDH5α、E. coliJM110菌种从-80℃冰箱中取出，分别在LB固体平板培养基上划线，37℃倒置培养12-16h。

2.用接种环从平板上分别蘸取一个单菌落在25mLSOB液体培养基搅拌一下，37℃180rpm震荡12-16h。

3.取1mL过夜E. coliDH5α、E. coliJM110菌液分别放于含有100mLSOB的1L锥形瓶中，37℃，180rpm震荡，每隔15-20min测定OD600，至OD600=0.3-0.4；

4.每50mL培养液转至无菌、冰预冷的聚丙烯管中，冷却10min。

5.4100rpm，4℃，10min，弃上清，吸尽液体。

6.将30mL预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶液加入到每50mL初始培养液中，重悬细胞沉淀。

7.4100rpm，4℃，10min，弃上清，吸尽液体。

8.将2mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液加入每50 mL初始培养液重悬。

9.每4mL重悬细胞加入140µl DMSO，轻旋混匀，冰浴15min。

10.重复步骤9。

11.以每100µl 一管的规格迅速分装入无菌、预冷的EP管中，写好名称和日期，-80℃保存。

2.2.4.4 T载体连接upp敲除同源臂

1.切胶回收后的融合片段与T载体连接，反应体系如下：

阳性对照：

样品	用量
pMD19-T	1µl (50ng/µl )
Control片段	1µl (50ng/µl )
ddH2O	3µl (up to 5µl )
SolutionⅠ	5µl

阴性对照：

样品	用量
pMD19-T	1µl (50ng/µl )
ddH2O	4µl (up to 5µl )
SolutionⅠ	5µl

T-upp体系（10µl ）：

样品	用量
pMD19-T	1µl (50ng/µl )
upp回收片段	4µl (29.8ng/µl )
ddH2O	0
SolutionⅠ	5µl

2.16℃，45min（可适当延长）。

3.10µl 全量加入100µl E. coliDH5α感受态中，20min冰浴。

4. 热激42℃90s，勿摇动，冰浴2min。

5.加900µl SOC培养基，最低转速54rpm，45min。

6.每200µl 涂于避光晾干的X-Gal、IPTG的Amp LB平板上。

7.32℃倒置过夜培养12-16h。

8.计数白色、蓝色菌落。

9.对白色菌落进行挑选，确认载体中插入片段的长度大小可以使用PCR法。

　2.2.4.5菌落PCR

无菌操作下，向200µl EP管中加入20µl 灭菌蒸馏水，用灭菌好的小枪头蘸取转化平板上10个单菌落（在平板上做好标记，放在准备好的蒸馏水中。再把同一枪头放在液体Amp LB 培养基中摇菌备用。吸取含有单菌落的EP管中部液体3µl做菌落PCR的模板，PCR体系如下：

添加物	用量
模板	3µl
UP-F	0.5µl
DN-R	0.5µl
2×Taq Mix	5µl
ddH2O	16µl
总计	25µl

循环体系如下：

94℃	5min
94℃	30s
60℃	30s
72℃	2min
72℃	10min
4℃	∞

　2.2.4.6质粒DNA的提取

采用天根DP103提质粒小试剂盒。

向离心管中加入3 mL过夜培养的T-upp菌液，12000 rpm 4℃离心1 min，可用移液枪去除上清培养液。

2.向含菌体沉淀的离心管中加入250 µl事先加好的RNase A溶液S1(由于有酶所以4℃保存)，使用涡旋振荡器对悬浮细菌进行充分沉淀。

3.250 µl溶液S2加入到向离心管中，温和并充分混合均匀使菌体充分裂解（翻转6-8次），至形成透亮的溶液，整个过程不益超过5min。

4.向离心管中加入350 µl溶液S3，温和并充分混合均匀使菌体充分裂解（避免剧烈摇晃导致基因组DNA污染），此时白色絮状沉淀出现。4℃12000 rpm离心10 min。

5.吸附柱置于收集管中，将离心后得到的上清液转移到吸附柱CP3中。12000 rpm4℃离心60s，去除废液，将吸附柱CP3再次置回收集管。

6.将500 µl漂洗液W1加入到吸附柱CP3中，在温度为4℃的条件下，以12000 rpm的离心速度进行60s的离心，除去废液，将吸附柱CP3置于收集管中。

7.向收集管中加入700µl事先已加好无水乙醇的W2,12000 rpm4℃离心60s，弃滤液，再重复一次这一步骤，保证盐分完全清除，消除对后续酶切的影响。

8.为了将吸附柱中残余的漂洗液除尽，12000 rpm4℃离心2 min。

9.在干净的离心管中，放入吸附柱CP3，向弃圆片膜中央滴加（悬空）60µl Eluent洗脱缓冲液（提前水浴65℃可增加洗脱效率），室温放置1min，12000 rpm4℃离心2 min，将离心管中收集到质粒溶液保存好，注明名称日期，-20℃保存。

　2.2.5upp片段与温敏质粒pKSV7连接

　　2.2.5.1 T-upp载体、温敏质粒pKSV7酶切

酶切体系：

添加物	用量
pKSV7（161.4ng/uL）	6µl
10×MBuffer	2µl
KpnI	1µl
EcoRI	1µl
ddH2O	10µl
总计	20µl

添加物	用量
T-upp（106.9ng/uL）	6µl
10×MBuffer	2µl
KpnI	1µl
EcoRI	1µl
ddH2O	10µl
总计	20µl

37℃金属浴温育3h。酶切后回收纯化pKSV7线性质粒与upp片段，再将upp片段与线性温敏质粒pKSV7连接，16℃金属浴温育过夜。连接体系：

添加物	用量
pKSV7（13.5ng/µl ）	2µl
upp（3.6 ng/µl ）	4µl
10×ligation buffer	2µl
T4 DNA Ligase	1µl
ddH2O	11µl
总计	20µl

　2.2.5.2热激转化pKSV7与upp片段

1.在无菌操作下，将过夜连接的产物pKSV7-Δupp加入100µl E. coliDH5α感受态中，冰浴30min，42℃热激90s，轻放至冰盒内冰浴3min。加900µl SOC培养基，37℃ 最低转速54rpm，40min。每200µl涂于晾干的含Amp的LB板上。37℃倒置过夜培养12-16h。

2.pKSV7-Δupp菌落进行PCR及酶切验证。

3.将之前过夜连接的产物pKSV7- Δupp转化入E. coliJM110感受态中，重复步骤一的操作。

　2.2.6利用BamHI甲基转移酶进行甲基化处理

添加物	用量
pKSV7- Δupp（约4ug）	20µl
10×Bam HⅠBuffer	10µl
SAM	0.5µl
BamHⅠ甲基转移酶	1µl
ddH2O	68.5µl
总计	100µl

37℃处理1h，80℃，5min。

　　2.2.7 解淀粉芽孢杆菌感受态及电转化条件摸索[43]

1.解淀粉芽孢杆菌C10感受态细胞生长培养基

LBS：每升水0.5 M山梨糖醇，10克氯化钠，10克胰蛋白胨和5克酵母提取物。

LBSP：每升水0.5 M山梨糖醇，0.05M KH2PO4，0.05 MK2HPO4，10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5克酵母提取物。

NCM：0.2 M NaCl，5 g葡萄糖，0.1 M KH2 PO4，5 g胰蛋白，0.5 M山梨糖醇，10 mM柠檬酸钠，1克酵母提取物，0.2 mM MgSO4·7H2O。

生长期：OD 6000.7-1。电场强度：800-2600 V。细胞壁弱化剂：20％（w/v）甘氨酸溶液，5％Tween 80（w/v）溶液，12.5％DL -苏氨酸溶液，10μg/mL氨苄青霉素。重悬缓冲液：MSG缓冲液（0.5 M山梨糖醇，0.5 M甘露糖醇和10％甘油），MKK缓冲液（0.5 mM MgCl2，每升水 0.25 mM KH2 PO4和0.25 mM KH2PO 4，pH 7.2），SMKK缓冲液（每升水272 mM蔗糖， 0.5mM MgCl2，0.5 mM K2HPO4和0.5mM KH2PO4，pH7.2）TSM缓冲液（每升水0.5M海藻糖，0.5 M山梨糖醇和0.5 M甘露醇）

　2.2.8解淀粉芽孢杆菌C10感受态制备

1.将实验室保存的解淀粉芽孢杆菌 C10菌株在 LB 平板上划线，蘸取单菌落于该液体培养基内，32℃ 180rpm过夜培养。

2.以1%接种量转移至有100 mL 生长培养基的三角瓶中，32 ℃振荡培养至 OD600=0.7-1。

3.8000g 4 ℃ 20 min离心，除尽上清。

4.用洗涤缓冲液将菌体重悬。

5.8 000 g 4 ℃ 10 min离心，除尽上清。

6.重复步骤4和5三次。

7.用含有14%PEG6000、0.5 M甘露醇、10%甘油和0.5 M山梨醇的重悬缓冲液，将洗涤后的菌体进行重悬，每100 µl分装成一管，-80℃保存。

　2.2.9解淀粉芽孢杆菌 C10电转化

先处理电转杯：使用75%酒精对电转杯进行清洗，对其进行20min以上的紫外灭菌，将其和枪头（200uL、10uL）放在冰上预冷。取100 µl 解淀粉芽孢杆菌 C10感受态细胞和4uL预处理甲基化的pKSV7- Δupp质粒加入电转杯，冰上静置2min。电击后立刻加入复苏培养基900 uL，培养基里含有0.38M甘露醇和0.5 M山梨醇，180rpm 32℃复苏3h，涂布含Cm的LB平板。

　2.2.10 筛选C10Δupp初始菌株

首先，将获得的转化子富集并在补充有氯霉素的LB液体培养基中在30℃下培养过夜。然后将10µl 细菌溶液吸移到含有氯霉素的LB液体培养基中，并在42℃下孵育12 h。将溶液稀释1000倍后，在LB平板上（含氯霉素）进行涂布，在温度为42℃的条件下，对其进行培养过夜。理论上，LB平板上生长的菌落时单交换菌株。在LB液体中（有氯霉素）加入单个交换菌落，然后对其进行12h的培养，然后将10µl 细菌溶液吸移到不含氯霉素的LB液体培养基中，在42℃传代培养24 h，每12 h转移一次。继代培养后，将培养物稀释103至105倍，并涂覆含有1.3mM 5-FU的LB固体板。在42℃下孵育12小时后，菌落开始生长。使用引物UppOUT-F / UppOUT-R检测这些菌落。

2.2.11生长曲线的确定

将待测菌株的甘油管在-80℃下从冰箱中取出，将其接种在LB平板上培养过夜。当单个菌落生长时，将其放入装有LB液体培养基的试管中。在温度为32℃的条件下，对其进行约12h的培养。然后测量其OD600，测量工具为紫外分光光度计，然后按10%的接种量将其接种到装有100 mL液体LB的500 mL锥形瓶中。将锥形瓶放在振荡培养的培养箱中，定期取出1 mL细菌溶液，测量其OD600值，以OD值为纵坐标绘制生长曲线，以横坐标为培养时间来表征其生长 。

　2.3结果与讨论

　　2.3.1解淀粉芽孢杆菌 C10对5-氟尿嘧啶（5-FU）耐受浓度

菌种活化后挑取平板上三个单菌落进行32℃摇培后涂抹5-FU的平板（不同浓度）。存活率的计算：存活率为5-FU 平板上的菌落数与DMSO平板上的菌落数之比。

如图2-1所示，解淀粉芽孢杆菌C10对 5-FU 具有敏感性。C10细胞的存活

图2-1 解淀粉芽孢杆菌C10耐受5-FU 实验

Figure 2-1 5-FU tolerance test of Bacillus amyloliquefaciens C10

率，随着5-FU浓度的增加，逐步降低，直至存活率为0。这时0.35mM的5-FU就可作为后续筛选时的工作浓度。

　2.3.2 upp上下游基因扩增

要将upp用作反向筛选标记，首先需要构建一个缺失upp基因的菌株。使用引物对UppUP-F/UppUP-R和UppDN-F/UppDN-R分别扩增upp基因上游和下游约500 bp的DNA片段。在下一个重叠PCR中，使用引物对UppUP-F/ UppDN-R将上游和下游同源臂融合在一起。结果如图2-2所示。条带大小为1100bp左右，即为上下游同源臂融合成功。

图2-2 upp上下游基因扩增电泳图

Figure 2-2 Electrophoresis of upstream and downstream gene amplification of upp

　2.3.3 pKSV7-Δupp载体的构建

将 pMD19-T simple 载体与同源臂进行连接，对其进行酶切、测序验证后，将其与KpnI或 EcoRI（pKSV7 ）的酶切位点进行连接，最后形成质粒pKSV7-Δupp。将质粒 pKSV7-Δupp转化 E. coli JM110，然后对质粒进行提取，进行甲基化处理，其酶为Bam HI 甲基转移酶，为下面的电转化做好准备。结果如图2-3所示。

图2-3 pKSV7-Δupp载体酶切图，泳道1、2、3、均为pKSV7-Δupp质粒，酶切结果约为7000bp与1100bp两条带，即pKSV7质粒与upp片段连接成功。

Figure 2-3 pKSV7-Δuppvector digestion map. Lanes 1, 2, and 3 are all pKSV7-Δupp plasmids. The digestion results are about 7000bp and 1100bp, which means that pKSV7 and upp are successfully linked.

　2.3.4 pKSV7-Δupp载体电转化解淀粉芽孢杆菌C10感受态细胞

　　2.3.4.1解淀粉芽孢杆菌C10感受态电转化条件建立

通过LB培养基过夜培养的解淀粉芽孢杆菌 C10在LBS培养基中转接，同时添加0.64%甘氨酸溶液，0.05%Tween 80（w/v）溶液，1.02%DL -苏氨酸溶液，32 ℃振荡培养至 OD600=0.9。重悬感受态细胞时用MSG缓冲液，按照2.2.8方法制备感受态。电转化时预设电压为2000V，电击时间为5ms,电击后立刻复苏培养。

2.3.4.2解淀粉芽孢杆菌C10Δupp菌株的筛选

分析图2-4可知，野生型的C10可以获得片段约1800 bp，因upp阅读框的缺少，突变株只获得约1200 bp的片段。对该片段的进一步DNA测序证明，成功敲除了upp基因。这些菌株之一被称为解淀粉芽孢杆菌C10Δupp，作为随后敲除的初始菌株。

图2-4为 upp基因敲除 PCR 验证的电泳图。泳道WT的模板为野生型染色体 DNA ，泳道Δupp的模板为突变株染色体 DNA，引物是UppOUT-R和UppOUT-F。由于突变株中缺失upp基因,泳道Δupp中的 PCR 片段比野生型的要短。

Figure 2-4uppgene knockout PCR verification electrophoresis. Lane Δuppuses mutant chromosomal DNA as a template, and lane WT uses wild-type chromosomal DNA as a template. The primers are UppOUT-F and UppOUT-R. Due to the deletion of the upp gene in the mutant strain, the PCR fragment in lane Δuppis shorter than the wild type.

　2.3.5 upp基因缺失对菌株生长能力的影响

为了upp基因敲除后不影响菌株的生长，也不影响我们后续实验，这样才能将突变菌株C10Δupp作为随后敲除的初始菌株进行下一步的分子改造。为了鉴定upp基因敲除后的生长状况，对上述实验获得的upp基因敲除菌株C10Δupp菌株和原始菌株 C10进行了生长曲线测定。结果如图2-5。在LB培养基中，C10和C10Δupp在最初的40 h里表现出了极其相似的生长情况，40h以后C10较突变菌株C10Δupp有轻微的优势。综上说明，upp基因的缺失对菌株生长速率没有影响。因此可以利用upp基因作为反向筛选标记基因对解淀粉芽孢杆菌进行遗传学改造。

图2-5 C10Δupp菌株和原始菌株 C10生长情况比较。

Figure 2-5Comparison of growth of C10Δupp strain and original strain C10.

　2.3.6 讨论

在C10 中构建基因的操作过程中，最好能够选择温度敏感型质粒，因为与枯草芽孢杆菌相比，解淀粉芽孢杆菌C10不能对PCR 片段进行转化，对质粒的转化程度相对较低。在筛选单交换菌株的过程中，以温度敏感型质粒为基础的基因敲除方法，其特点是不依赖转化效率。一个转化子就可以筛选基因敲除突变株。在温度高于37℃的条件下，通过同源臂，pKSV7可以整合到宿主细胞染色体上，然后对其进行传代培养（不添加氯霉素），通过第二次的同源重组，质粒有从染色体上脱落的概率，最后使细菌恢复野生型或发生目的突变。概率越大，其敲除的筛选就越容易。但分析实验结果可知，pKSV7 从C10染色体上脱落的概率＜1/400。因此，为了排除二次同源重组的单交换菌株，就需要制定一个反向筛选标记。在枯草芽孢杆菌中，有3个比较成熟的反向筛选标记：1.I-SceI，包括在载体构建过程中，需要添加识别位点18 bp，然后通过对酶进行表达，来切割染色体；2.mazF，在大肠杆菌中，mazF编码了一个毒蛋白，整个敲除方法的效率会受到泄露表达的影响；3.还有一个就是upp。因此，需要构建一种快捷简单的无痕基因替换方法，从而对基因进行精简，对基因进行插入、敲除。与I-SceI和mazF相比，upp的优点有以下几点： (1)在不同菌株中，upp都有对应用方面的报道；(2)upp不需要添加诱导物或特定序列，该方法是最简单有效的；(3) 芽孢杆菌的内源基因是 upp的来源，其能够得到有效的表达，从而起到相应的作用。综上所述，本研究将pKSV7即温度敏感型质粒与upp反向筛选标记进行结合，在解淀粉芽孢杆菌C10中构建一个基因无痕替换方法，来完成常规的基因敲除、插入等遗传操作。

本试验首先构建了upp上下游同源臂，通过与T载体连接，获得大量upp上下游同源臂片段，经过测序确认扩增片段正确。接着与同样酶切后的pKSV7相结合，构建pKSV7-Δupp载体，经酶切确认载体构建成功。在经过解淀粉芽孢杆菌C10感受态细胞生长培养基、生长期、电转化电场强度、细胞壁弱化剂、重悬缓冲液的条件的摸索，确定最终解淀粉芽孢杆菌 C10在LBS培养基中转接，同时添加0.64%甘氨酸溶液，0.05%Tween 80（w/v）溶液，1.02%DL -苏氨酸溶液，32 ℃振荡培养至 OD600=0.9。重悬感受态细胞时用MSG缓冲液，按照2.2.8方法制备感受态。电转化时预设电压为2000V，电击时间为5ms,电击后立刻复苏培养。此时，得到数个转化子，从最开始的没有转化子到能将外源DNA转入解淀粉芽孢杆菌中，虽然转化效率仍然需要进一步提高，但目前的转化条件为之后的电转化奠定了基础。经过upp基因敲除菌株C10Δupp菌株和原始菌株 C10进行了生长曲线测定，发现upp基因的缺失对菌株生长速率没有影响。因此可以利用upp基因作为反向筛选标记基因对解淀粉芽孢杆菌进行遗传学改造。

第三章 构建pKSV7-upp反向筛选质粒pKSU并进行功能验证

3.1实验材料

　　3.1.1 菌株及质粒

枯草芽孢杆菌168、解淀粉芽孢杆菌C10Δupp，温度敏感型质粒 pKSV7。

3.1.2实验试剂

Taq DNA 聚合酶、溶菌酶、DNA Marker III、pMD19-T simple、T4 DNA ligase、FastDigest Bam HI、FastDigest Kpn I、琼脂糖、溴化乙锭、EDTA、冰醋酸、氯化钠、酵母提取物琼脂粉、细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA 片段回收试剂盒、可溶性淀粉、0.2 µm纤维滤膜。

　　3.1.3 引物序列（表3-1）

表3-1 本节所用引物及序列

Table3-1 Primers and sequences used in this section

引物名称 引物序列

Upp-F ACAGGTACCGATCCTAAAACCCGCTTG Upp-R TGAGGATCCTTATTTTGTTCCAAACATGCGGTC

　3.1.4培养基及溶液

　　3.1.4.1 培养基和缓冲液

LB培养基：将10g的氯化钠、10g胰蛋白胨、5g的酵母提取物加入到950 ml的去离子水中，将混合液进行充分摇动，直到溶质完全溶解。将pH至7.0，可以使用NaOH5mol/L进行调节。然后使用离子水将溶液定容至1L。将1.5%-2.5%琼脂粉加入到固体培养基中，使用高压蒸汽对溶液进行灭菌。

电泳缓冲液（50×TAE）：将Na2EDTA·2H2O 37.2 g 和Tris242.0 g 加入到80000 mL的去离子水中，将其进行均匀搅拌，然后加入冰乙酸57.1 mL ，溶解充分后，使用去离子水将溶液定容至1 L，最后在室温的条件下进行保存。

　3.1.4.2 抗生素母液及工作浓度

氨苄（Amp）：在1 mL ddH2O中，加入100 mg 氨苄，将其进行充分溶解，溶解后将溶液进行过滤除菌，可以使用0.2 µm纤维滤膜，然后在温度为-20℃的条件下对母液进行避光保存。100 µg/mL为工作浓度。

氯霉素（Cm）：在无水乙醇中，加入34mg的氯霉素进行溶解，然后在温度为-20℃的条件下进行避光保存。5 µg/mL为其工作浓度。

5-FU即5-氟尿嘧啶母液：在1 mL的二甲基亚砜中，加入75 mg 5-FU进行溶解，将其充分混匀，在温度为-20℃的条件下进行保存备用。

　3.1.5实验设备

表3-2 仪器名称及生产厂家

Table 3-2 The instrument name and manufacturer

仪器名称	生产厂家
电子分析天平	上海西艾爱电子有限公司
高压蒸汽灭菌锅	江阴滨江医疗设备厂
低温离心机	Eppendorf
加热制冷型金属浴	卡尤迪生物科技
烘干箱	上海精宏实验设备有限公司
电泳仪	北京市六一仪器厂
WFH-201B紫外透射反射仪	上海精科实业有限公司
电热恒温振荡水槽	上海精宏实验设备有限公司
台式高速大容量离心机	Eppendorf
大容量恒温培养振荡器（摇床）	上海智城分析仪器制造有限公司
恒温培养箱	上海精宏实验设备有限公司
超净工作台	苏州净化设备有限公司
PCR仪	Eppendorf

3.2 试验方法

　　3.2.1 菌株活化

在严格进行无菌操作的条件下，用接种环挑取-80℃保存的菌株枯草芽孢杆菌168，在LB固体培养基平板上接种划线，放入32℃条件下过夜倒置培养。

　3.2.2反向筛选质粒PKSU的构建

以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，对upp阅读框及上游启动子和下游终止子进行扩增。

添加物	用量
168基因组DNA	5µl
Upp-F	1µl
Upp-R	1µl
2×Taq Mix	10µl
ddH2O	33µl
总计	50µl

循环体系如下：

将得到纯化upp阅读框及上游启动子和下游终止子片段与pMD19-T载体连接，经蓝白斑筛选得到T-uppE，测序后对pKSV7及T-uppE均进行Bam HI和Kpn I酶切，酶切体系如下：

添加物	用量
pKSV7（150.3ng/µl ）	5µl
10×MBuffer	2µl
KpnI	1µl
Bam HI	1µl
ddH2O	11µl
总计	20µl

添加物	用量
T-uppE（100.2ng/µl ）	5µl
10×MBuffer	2µl
KpnI	1µl
Bam HI	1µl
ddH2O	11µl
总计	20µl

37℃金属浴温育3h。酶切后回收纯化pKSV7线性质粒与uppE片段，再将uppE片段与线性温敏质粒pKSV7连接，16℃金属浴温育过夜。连接体系如下：

添加物	用量
pKSV7（13.6ng/µl）	2µl
uppE（4.0ng/µl）	4µl
10×ligation buffer	2µl
T4 DNA Ligase	1µl
ddH2O	11µl
总计	20µl

　3.2.3反向筛选质粒pKSU功能验证

将pKSU转化至解淀粉芽孢杆菌C10Δupp以获得突变菌株C10Δupp（pKSU）。C10Δupp（pKSU）与氯霉素在30℃下培养过夜。稀释1000次后，涂布于添加0.35mM 5-FU的LB平板。用突变菌株C10Δupp作为对照组。

3.3结果与讨论

　　3.3.1反向筛选质粒pKSU载体的构建

由于解淀粉芽孢杆菌C10的upp基因与枯草芽孢杆菌168的相似性较高，而枯草芽孢杆菌168的上下游调节序列和upp阅读框已经得到相关报道[44]。于是在枯草芽孢杆菌168中，直接利用引物Upp-R或者 Upp-F对上游启动子、下游启动子以及upp阅读框进行克隆, 经BamHI和KpnI酶切后连接 pKSV7，得到反向筛选质粒 pKSU（图3-1）。

图3-1 pKSU 酶切验证电泳图。M代表DNA marker III。

Figure 3-1 pKSU digestion electrophoresis. M stands for DNA marker III.

　3.3.2 反向筛选质粒pKSU功能验证

结果如图3-2所示，pKSU的回补恢复了C10Δupp对5-FU的敏感性，而5-FU对突变菌株C10Δupp没有影响。实验结果显示，在解淀粉芽孢杆菌C10中，upp基因可以将外源5-FU转化为毒性物质，表明作为一种反向筛选标记的upp可以在解淀粉芽孢杆菌C10中应用。

图3-2 pKSU对upp敲除菌株进行回补。左：C10Δupp，右：C10Δupp（pKSU）。

Figure 3-2 pKSU complements upp knockout strains. Left: C10Δupp, right: C10Δupp（pKSU）.

通过构建含有upp基因的pKSV7载体，再一次将含有upp表达盒的反向筛选质粒 pKSU通过接合转移导入解淀粉芽孢杆菌C10Δupp。将重新导入upp基因的突变菌株C10Δupp（pKSU）和突变菌株 C10Δupp在 0.35mM的5-FU的平板上涂布，在 5-FU 平板上，pKSU即C10Δupp不能正常生长，说明5-FU的敏感性在upp基因回补菌株的情况下又得到恢复，因此，在解淀粉芽孢杆菌遗传改造中，upp基因作为反向标记基因可以应用于实际操作。

第四章 α-淀粉酶基因amyA的敲除

4.1实验材料

　　4.1.1 菌株及质粒

解淀粉芽孢杆菌C10、解淀粉芽孢杆菌C10Δupp，质粒 pKSU。

　4.1.2实验试剂

Taq DNA 聚合酶、溶菌酶、DNA Marker III、pMD19-T simple、T4 DNA ligase、FastDigest Bam HI、FastDigest Kpn I、琼脂糖、溴化乙锭、EDTA、冰醋酸、氯化钠、酵母提取物琼脂粉、细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA 片段回收试剂盒、可溶性淀粉、0.2 µm纤维滤膜。

　4.1.3 引物序列（表4-1）

表4-1 本节所用引物及序列

Table4-1 Primers and sequences used in this section

引物名称 引物序列

AmyUP-F GCGCTCTAGAGCCTGAAATTAAAAAGCTGGC AmyUP-R ACATAAATGGAGACCACAAGTCTGAACGAAAC AmyDN-F CGTTCAGACTTGTGGTCTCCATTTATGTTCAG AmyDN-R CGAGTCTAGATTGTTGAAGGCAAATATCTG AmyOUT-F TCTCAGCGGAAAAAGAATCATC AmyOUT-R GCTTATTTCGACCAGCTGATTC

　4.1.4培养基及溶液

　　4.1.4.1培养基和缓冲液

LB培养基：将10g的氯化钠、10g胰蛋白胨、5g的酵母提取物加入到950 ml的去离子水中，将混合液进行充分摇动，直到溶质完全溶解。将pH至7.0，可以使用NaOH5mol/L进行调节。然后使用离子水将溶液定容至1L。将1.5%-2.5%琼脂粉加入到固体培养基中，使用高压蒸汽对溶液进行灭菌。

电泳缓冲液（50×TAE）：将Na2EDTA·2H2O 37.2 g 和Tris242.0 g 加入到80000 mL的去离子水中，将其进行均匀搅拌，然后加入冰乙酸57.1 mL ，溶解充分后，使用去离子水将溶液定容至1 L，最后在室温的条件下进行保存。

　　4.1.4.2 抗生素母液及工作浓度

氨苄（Amp）：在1 mL ddH2O中，将氨苄 100 mg 溶解在其中，溶解后对其进行过滤除菌，过滤过程可以使用0.2 µm纤维滤膜，在温度为-20℃的条件下对母液进行避光保存。100 µg/mL为其工作浓度。

氯霉素（Cm）：在无水乙醇中，取氯霉素称34 mg 溶解于其中，然后在温度为-20℃的避光条件下进行保存。其中5 µg/mL为工作浓度。

　4.1.5实验设备

表4-2 仪器名称及生产厂家

Table 4-2 The instrument name and manufacturer

仪器名称	生产厂家
电子分析天平	上海西艾爱电子有限公司
高压蒸汽灭菌锅	江阴滨江医疗设备厂
低温离心机	Eppendorf
加热制冷型金属浴	卡尤迪生物科技
烘干箱	上海精宏实验设备有限公司
电泳仪	北京市六一仪器厂
WFH-201B紫外透射反射仪	上海精科实业有限公司
电热恒温振荡水槽	上海精宏实验设备有限公司
台式高速大容量离心机	Eppendorf
大容量恒温培养振荡器（摇床）	上海智城分析仪器制造有限公司
恒温培养箱	上海精宏实验设备有限公司
超净工作台	苏州净化设备有限公司
PCR仪	Eppendorf

　4.2 试验方法

　　4.2.1 菌株活化

在严格进行无菌操作的条件下，用接种环挑取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌C10，在LB固体培养基平板上接种划线，放入32℃条件下过夜倒置培养，E. coliDH5α、E. coliJM110在LB平板上划线，于37℃条件下过夜倒置培养。

4.2.2敲除载体 pKSU-ΔamyA构建

　　4.2.2.1 amyA基因的融合PCR反应

以解淀粉芽孢杆菌C10基因组DNA为模板，对amyA基因上游扩增体系如下：

添加物	用量
C10基因组DNA	2µl
AmyUP-F	1µl
AmyUP-R	1µl
2×Taq Mix	25µl
ddH2O	21µl
总计	50µl

循环体系如下：

94℃	3min
94℃	30s
61℃	30s
72℃	1min
72℃	10min
4℃	∞

amyA基因下游扩增体系如下：

添加物	用量
C10基因组DNA	2µl
AmyDN-F	1µl
AmyDN-R	1µl
2×Taq Mix	25µl
ddH2O	21µl
总计	50µl

循环体系如下：

94℃	3min
94℃	30s
63℃	30s
72℃	1min
72℃	10min
4℃	∞

将获得的上、下游同源臂进行切胶回收，得到纯化的amyA-UP 和amyA-DN，按照如下体系进行融合反应：

添加物	用量
amyA-UP	2µl
amyA-DN	4µl
AmyUP-F	1µl
AmyDN-R	1µl
2×Taq Mix	25µl
ddH2O	17µl
总计	50µl

循环体系如下：

94℃	3min
94℃	30s
63℃	30s
72℃	2min
72℃	10min
4℃	∞

　4.2.2.2 pMD19-T与amyA基因的连接反应

将amyA基因片段与T载体切胶回收，进行连接，反应体系如下：

阳性对照：

样品	用量
pMD19-T	1µl (50ng/µl )
Control片段	1µl (50ng/µl )
ddH2O	3µl (up to 5µl )
SolutionⅠ	5µl

阴性对照：

样品	用量
pMD19-T	1µl (50ng/µl )
ddH2O	4µl (up to 5µl )
SolutionⅠ	5µl

T-amyA体系（10µl ）：

样品	用量
pMD19-T	1µl (50ng/µl )
amyA回收片段	2µl (68.5ng/µl )
ddH2O	2
SolutionⅠ	5µl

2.16℃，45min（可适当延长）。

3.10µl 全量加入100µl E. coliDH5α感受态中，20min冰浴。

4. 热激42℃90s，勿摇动，冰浴2min。

5.加900µl SOC培养基，最低转速54rpm，45min。

6.每200µl 涂于避光晾干的X-Gal、IPTG的Amp LB平板上。

7.32℃倒置过夜培养12-16h。

8.对蓝色、白色菌落进行计数。

9.在白色菌落中，载体插入片段放入长度大小可以使用PCR进行检测。

4.2.2.3 pKSU与amyA基因的连接反应

T-amyA载体、pKSU酶切体系：

添加物	用量
pKSU（150.9ng/uL）	6µl
10×MBuffer	2µl
Xba I	1µl
0.1%BSA	2µl
ddH2O	9µl
总计	20µl

添加物	用量
T-amyA（120.4ng/uL）	6µl
10×MBuffer	2µl
Xba I	1µl
0.1%BSA	2µl
ddH2O	9µl
总计	20µl

37℃金属浴温育3h。将酶切后回收纯化amyA、pKSU片段连接，16℃金属浴温育过夜。连接体系：

添加物	用量
pKSU（12.5ng/µl）	2µl
amyA（3.6ng/µl）	4µl
10×ligation buffer	2µl
T4 DNA Ligase	1µl
ddH2O	11µl
总计	20µl

经过转化进入E. coliJM110感受态，对长出的单菌落进行PCR及酶切验证，随后经测序后得到敲除载体 pKSU-ΔamyA。将敲除载体经过第二章优化的电转化条件转入解淀粉芽孢杆菌C10Δupp中，进行敲除。

　4.2.3 α-淀粉酶基因amyA的敲除

首先，在LB溶液中（含有氯霉素），将细菌溶液（含有敲除质粒）转移到其中，在温度为42℃的条件下培养约12小时。在此过程中质粒很容易丢失，并且只有在染色体对一个同源臂进行整合时，其氯霉素抗性才能得到保存。在氯霉素平板上，将稀释后的菌液（过夜）涂布在上面，在温度为42℃的情况下，对菌液培养过夜。在LB板中（含有氯霉素），将生长的单个菌落接种到上面，并对其进行12h的培养。在不含氯霉素的 LB液体培养基中，转接单交换菌株，在温度为42℃的情况下，每隔12h进行1次转接，总共培养24h，转接2次。传代结束后，将培养物稀释稀释到10-3~10-5，然后在LB平板（1.3m M5-FU）上进行涂布含有的，在温度为42℃的条件下对其进行12h的培养，菌落开始生长。

　4.2.4 淀粉水解实验

分析淀粉水解实验结果，对amyA基因的敲除进行确定。将10μLC10Δupp和C10ΔuppΔamyA细菌（过夜培养）滴加到装有淀粉培养基（添加2％可溶性淀粉的LB）的牛津杯中，并在37°C下培养24小时。用移液管吸收1mL碘液，在培养基表面，将其均匀地滴在上面，并对菌落周围进行观察，看是否有水解环。

　4.3结果与讨论

　　4.3.1敲除载体 pKSU-ΔamyA构建的构建

以解淀粉芽孢杆菌C10基因组DNA为模板，用引物对AmyUP-F、AmyUP-R、AmyDN-F、AmyDN-R对amyA基因上、下游序列进行扩增。使用Xba I对同源臂用进行单酶切，并与pKSU（相同酶切）进行连接，最后形成pKSU-ΔamyA即敲除载体，图4-1为具体内容。

图4-1敲除载体 pKSU-ΔamyA酶切验证图谱。泳道1,2均为pKSU-ΔamyA，M: DNA 1kb marker。

Figure 4-1 The digestion verification map of the knockout vector pKSU-ΔamyA. Lanes 1 and 2 are pKSU-ΔamyA, M: DNA 1kb marker.

4.3.2菌株C10ΔuppΔamyA的筛选

完成筛选后，首先，对氯霉素敏感性（生长的单个菌落）进行测试。然后使用平板影印技术对菌落进行双交换验证，该菌落不能在氯霉素平板上生长，只可以在5-FU平板上生长。 AmyAOUT-R和AmyAOUT-F 的区分可以使用野生菌株和 敲除菌株。 使用敲除菌株的染色体DNA作为模板，如上所述，通过PCR扩增可获得约1200bp的片段，而野生型可获得约2500bp的片段，如图4-2所示。将PCR阳性菌株在LB固体平板上划线。菌落生长后，挑出单个菌落，然后使用引物AmyAOUT-R和AmyAOUT-F对其进一步的测试。 确认无误后测定此片段的顺序。测序结果显示，已经成功敲除amyA基因，C10ΔuppΔamyA即为所敲除菌株。

图4-2 amyA因敲除菌株PCR检测电泳图，M: DNAmarkerⅢ。

Figure 4-2 PCR electrophoresis of amyA due to the knockout strain, M: DNA marker III.

4.3.3淀粉水解实验

分析淀粉水解实验的结果，得出了amyA基因的敲除。 将过夜培养的10µl C10Δupp和C10ΔuppΔamyA细菌滴加到装有淀粉培养基（添加2％可溶性淀粉的LB）的牛津杯中，并在37°C下培养24小时。用移液管吸收1mL碘液，在培养基表面，将其均匀地滴在里面，对菌落周围进行观察，看是否有水解环。由图4-3可知，在没有α-淀粉酶的情况下，LL3ΔuppΔamyA不能形成水解环。但是在具有淀粉酶的条件下，LL3Δupp能够形成明显的水解环。因此，成功的构建敲除菌株LL3ΔuppΔamyA，由此表明，在温度敏感质粒和upp的基础上，使用无痕基因敲除方法对淀粉进行水解比较可行。

图 4-3野生型菌株（左）和amyA突变株（右）的淀粉水解实验。

Figure4-3Starch hydrolysis experiments of wild-type strains (left) and amyAmutant (right).

　4.3.4讨论

在上一章验证了upp基因的回补能恢复突变菌株C10Δupp对5-FU的敏感性，证实了upp基因能够作为解淀粉芽孢杆菌的反向筛选标记。本章通过用传统方法构建敲除载体pKSU-ΔamyA，经过电转化进入突变菌株C10Δupp，经过氯霉素与5-FU敏感性检测后，通过引物对AmyAOUT-F / AmyAOUT-R对野生型和突变体进行PCR检测后，得到突变菌株C10ΔuppΔamyA。后续为了证实敲除amy基因发挥其作用，对突变菌株C10ΔuppΔamyA进行了淀粉酶水解实验。实验结果显示，突变菌株C10ΔuppΔamyA由于α-淀粉酶基因的缺失，不能形成水解圈。实验的成功证实了解淀粉芽孢杆菌C10中基因敲除体系的成功建立，为后续在解淀粉芽孢杆菌C10中的遗传操作奠定了基础。

在实验操作过程中，利用无缝克隆技术连接载体和片段。其中，在PCR产物两端，会携带上与载体序列同源性的碱基15-20个，这是因为扩增目的DNA片段和设计基因克隆的的方法通常与常规PCR法一致，其中不同的是引物末端和载体末端具有同源碱基15-20个。为了能够使目的DNA和载体的两端出现序列（互补配对），可以使用酶试剂对其进行处理，然后除去目的DNA和载体上双链中的一条链（同源片段上），在没有酶联的情况下，为使目的DNA和载体能够紧密联系，可以依靠同源序列碱基间进行配对来完成，然后直接进行转化。在试验过程中，使用传统的PCR产物克隆方法具有一定的缺陷，不仅耗费精力，而且用时长，其主要有以下两种类型：1.TA载体连接；2.在是PCR引物设计的过程中，将载体上的酶切位点引入，然后的到PCR产物，其经过双酶切后，最后将克隆到目的载体上。要想对传统的双酶切进行突破，并且在此基础上进行连接，使用一步重组法，就可以得到重组载体（高效率克隆）。为了克服传统的克隆方法，可以采用组装技术和无缝克隆，这种克隆方法具有简洁、全新、快速的特点，在不需要连接酶和内切酶的情况下，可以在质粒的任何位点，插入一个或多个目标DNA片断。本实验没有提供实验数据，只是在实验当中尝试了此种方法的可行性，为以后的载体构建提供了更多的选择。

总结与展望

总结

本研究为得到C10Δupp即突变菌株，首先要对尿嘧啶磷酸核糖转移酶进行编码，其编码基因为upp基因，然后再将upp基因敲除（解淀粉芽孢杆菌C10中），其原理为利用 5-FU即体外胸腺嘧啶类似物进行相应的反应，最后产生对菌体有毒的5-dUMP。在底盘细胞的基础上，成功的构建了pKSU-ΔamyA即自杀型基因敲除载体，这种载体中含有upp基因，这种载体可以敲除amyA基因片段（C10中）。通过该研究表明，反向筛选标记基因upp可以有效的敲除目的基因基因，与传统的敲除方法相比，该方法在不引入标记基因的条件下，其试验时间至少减少14天，从而假阳性的概率降低，因此，这个方法可以连续无痕的敲除多基因。在对解淀粉芽孢杆菌菌株的研究过程中，该方法可以提供一定的技术指导，可以在代谢工程改造中进行广泛应用。主要结论如下：

构建的pKSV7-Δupp载体经酶切以及测序确认载体构建成功。在探索解淀粉芽孢杆菌C10的电转化条件后，确定通过LB培养基过夜培养的解淀粉芽孢杆菌 C10在LBS培养基（每升水0.5 M山梨糖醇，10克氯化钠，10克胰蛋白胨和5克酵母提取物）中转接，同时添加0.64%甘氨酸溶液，0.05%Tween 80（w/v）溶液，1.02%DL -苏氨酸溶液，32 ℃振荡培养至 OD600=0.9。重悬感受态细胞时用MSG缓冲液（0.5 M山梨糖醇，0.5 M甘露糖醇和10％甘油）。电转化时预设电压为2000V，电击时间为5ms,电击后加900 uL复苏培养基（LB培养基里加0.5 M山梨醇，0.38M甘露醇），180rpm 32℃复苏3h，涂布含Cm的LB平板。经过对upp基因敲除菌株C10Δupp菌株和原始菌株 C10进行了生长曲线测定，发现upp基因的缺失对菌株生长速率没有影响。将upp基因作为反向筛选标记基因，然后对解淀粉芽孢杆菌进行遗传学方面的改造。通过含有upp基因的pKSV7载体进行构建，再一次将含有upp表达盒的反向筛选质粒 pKSU通过接合转移导入解淀粉芽孢杆菌C10Δupp。将重新导入upp基因的突变菌株C10Δupp（pKSU）和突变菌株 C10Δupp在 0.35mM的5-FU的平板上涂布，在 5-FU 平板上，pKSU即C10Δupp不能进行正常生长，说明5-FU的敏感性在upp基因回补菌株的影响下又被唤起，由此可知，在淀粉芽孢杆菌遗传改造中，upp基因可以作为反向标记基因而存在。构建敲除载体pKSU-ΔamyA，经过电转化进入突变菌株C10Δupp，经过氯霉素与5-FU敏感性检测后，得到突变菌株C10ΔuppΔamyA。同时对突变菌株C10ΔuppΔamyA进行了淀粉酶水解实验。实验结果显示，突变菌株C10ΔuppΔamyA由于α-淀粉酶基因的缺失，不能形成水解圈。实验的成功证实了解淀粉芽孢杆菌C10中基因敲除体系的成功建立，为后续在解淀粉芽孢杆菌C10中的遗传操作奠定了基础。

      展望

解淀粉芽孢杆菌不仅在自然环境中广泛分布，不仅在土壤，植物根际表面，深海水等外部环境中，而且在植物中也很普遍，易于分离和培养，对人类和人类无毒无害。其代谢物丰富，具有广谱抗菌活性，抗逆性强，生长快，稳定性好，在植物病害的防治中具有多种有益作用，非常适合生物的大规模生产和应用。近年来解淀粉芽孢杆菌的染色体无痕修饰改造的技术方法，在目前看来已经属于一种成熟的技术，在菌种的合成生物学和遗传改造方面取得非常优秀的成绩。在枯草芽孢杆菌 168中，有研究者已经成功的制造出精简菌株，这种菌株的染色体缺失超过 1 M ，虽然其给人们带来了一定的好处，但是还是存在一些缺陷（Ara等）[45]。由于时间所限，本论文研究仍有较多不足之处，为进一步敲除C10中有利于发酵生产的关键基因，探索发酵合成代谢物的调控机理，可从下述几个方面继续进行研究：

1.继续优化解淀粉芽孢杆菌感受态细胞及电转化条件，提高电转化效率，建立更加高效、快速的电转体系。

2. 由于时间原因，后续可以敲除发酵通路上的关键负调控基因，提高发酵产物产量，用于实践生产当中。