病原体快速诊断方法学进展

摘 要 :随着侵入性治疗及广谱抗生素的广泛应用,病原菌对人类的危害越来越严重。目前,大多数临床微生物实验室对病原菌的诊断基于传统的培养和生化反应,其操作繁杂、诊断周期较长。因此,迫切需要新的快速检验技术替代现有技术,以下就病原体快速诊断方法

       摘 :随着侵入性治疗及广谱抗生素的广泛应用,病原菌对人类的危害越来越严重。目前,大多数临床微生物实验室对病原菌的诊断基于传统的培养和生化反应,其操作繁杂、诊断周期较长。因此,迫切需要新的快速检验技术替代现有技术,以下就病原体快速诊断方法学进展综述如下。
      关键词病原体;快速诊断;方法学 

1、病原体形态的直接镜检

       直接镜检是微生物实验室对病原体快速诊断的基本方法。根据不同病原体的结构及形态特征,利用特定的染色液对病原体进行染色镜下观察,如抗酸杆菌的抗酸染色、隐球菌的墨汁染色、卡氏肺孢子菌的六胺银染色、奴卡菌的弱抗酸、丝状真菌的棉兰染色等。另外根据标本的来源结合病原体的形态特征可对病原体进行鉴别诊断,如来自尿道或生殖器的可疑淋病奈瑟菌,来自米泔样便的霍乱弧菌,来自粘膜白斑的白喉棒状杆菌等。直接镜检法的灵敏性与人员的专业水平和标本的质量有很大关系,但直接镜检法能为临床提供及时有效的实验结果,特别是无菌部位标本的检测。陈东科[1]认为标本直接镜镜不仅可以快速检测病原微生物,还可以鉴别炎症的性质和污染菌。 

2、病原体代谢物快速检测

        2.1显色培养基对代谢物的快速检测  
        一些病原体在生长过程中能产生特定的代谢产物,作用于培养基后显示不同的颜色。利用这种特性不但可以筛选出病原体,还可以检测细菌特定的耐药表型。一系列商品化显色培养基就是如此产生的。如CHROMagar Listeria 定位显色培养基[2]-[3],李斯特菌在生长代谢过程中产生种属特异酶,在培养基内加入与之对应的显色酶底物,特异酶发挥对底物的水解效果产色。B群链球菌显色培养基利用其代谢产物作用于培养基,呈特征性浅粉色至红色菌落有效筛查出GBS[4]。目前可作筛选病原体的显色培养基还有艰难梭菌显色培养基、念珠菌显色培养基等[5]可检测特定耐药表型的培养基有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) [6]、产超广谱β内酰胺酶(ESBL)的肠杆菌科细菌[7]等。显色培养基对病原体的检测耗时短且灵敏度高,是预防控制多重耐药菌传播简便易行的有效方法。
      2.2 表面解析常压化学电离质谱(SDAPCI-MS)对代谢物的快速检测  
     大肠埃希菌在代谢过程中可产生挥发性有机代谢产物(VOCs),在 m/z 40-200 范围内 SDAPCI-MS扫描下获得 m/z 116 信号(吲哚)单离子质谱图。吲哚仅特异性存在于大肠埃希菌中,从而进行快速诊断[8]。表面解析常压化学电离质谱(SDAPCI-MS)作为一种新型的电离质谱技术,目前应用于生命科学等多个科学领域。对解决细菌鉴定方法耗时费力问题这一方面也有一定帮助。

3、病原体表面物质的快速检测

     β-1,3 葡聚糖是真菌细胞壁成分,在不同真菌细胞壁中的含量也不相同,目前针对此检验的方法(G试验)可用于检测念珠菌、卡氏肺孢子、毛孢子菌、镰刀霉、支顶孢霉等引起的侵袭性真菌感染。此试验作为血清标志物检测真菌无特异性,但有高的阴性预测值。连续2次试验阳性对提高侵袭性真菌病早期诊断有一定价值,但需要关注结果的假阳性[9]-[10]。半乳甘露聚糖是曲霉菌细胞壁成分,其释放量与曲霉菌菌量成正比,可以反映感染程度。疾病早期半乳甘露聚糖指数(GM试验)甚至可以预示侵袭性曲霉菌感染患者的临床结果和死亡率[11]。国内有学者[12]以血清GM值单次大于0.5为研究的界值,对侵袭性肺曲霉病诊断有着良好的敏感性及特异性,敏感度为 85.7%,特异度为86.5%、阳性预测值及阴性预测值分别为55%及 97% 。

4、病原体毒素的快速检测   

       有些病原体存在包括产毒株和不产毒株,直接检测细菌产生的毒素常比检测细菌更有意义,如艰难梭菌毒素A或B,大肠埃希菌热敏毒素(LT)与耐热毒素(ST),葡萄球菌的毒性休克综合征毒素-I(TSST-I)以及黄曲霉菌毒素等。毒素检测方法种类繁多,如对难梭菌毒素A和B的检测方法包括:“金标准”的产毒素细胞培养法,毒素A、B的酶联免疫法、免疫层析法,毒素基因的实时荧光PCR法等。由于细胞培养难度较高,测定时间长的缺点导致此方法难以普及,目前实验室较优常采用免疫方法及基因检测方法。酶联免疫法的敏感性低,使得此方法对艰难梭菌感染诊断变得不可靠,需要结合分子检测方法来确证[13]

5、病原体抗原或产生的抗体快速检测

       对于一些生长缓慢、难培养和危险度高的病原体(如军团菌、沙眼衣原体、粪便轮状病毒和呼吸道流感病毒等),抗原检测方法是一种比较快速的检测方法。病原体抗原检测方法也比较多,如基于直接免疫荧光法的七项呼吸道病毒抗原的联检 [14];基于抗血清法分型鉴定链球菌属、沙门菌属和志贺菌属等;基于不同载体(胶体金、明胶粒子、含蛋白 A 的金黄色葡萄球菌等)的凝集法鉴定新型隐球菌[15]、弯曲菌属[16]等。对于病原菌抗体的检测主要包括感染早期的IgM检测和后期的IgG检测,有的试剂可同时检测2种及以上抗体,如肺炎支原体抗体检测。另外对一些难以培养病原菌如结核分枝杆菌,分泌于菌体外的一种特异性较优高的蛋白MPB64,免疫胶体金法测定对其测定具有较高的特异度和灵敏度,方法简便、快速[17]

6、病原体基因快速检测

       病原体基因的快速检测技术主要包括对核酸进行扩增或不扩增检测,不扩增检测如原位杂交技术,扩增技术如各种PCR。适用的标本种类不限,可以是原始标本,也可以是培养或增菌过后的标本。
       6.1扩增的核酸快速检测技术  
        16S rRNA 广泛存在于细菌的细胞中,其基因序列包括保守区和可变区,保守区序列基本不变,可变区序列因细菌种属不同而异。16S rRNA 保留了大量的信息量又便于扩增和测序,很多微生物实验室以保守区序列设计引物,扩增出16S rRNA 序列后利用可变区序列的差异来对细菌进行鉴定。而真菌分子检测的靶基因主要为核糖体RNA基因,包括18S、ITS1、5.8S、ITS2和28S 区域,几乎可以将任何未知的真菌用靶向这些区域的通用引物进行扩增[18]。叶乃芳[19]等应用16SrRNA 序列分析技术对临床标本中疑难细菌的鉴定,鉴定到种水平成功率可达到90. 9%,鉴别能力明显高于常规方法。有学者应用基于 28S rRNA 基因序列的巢式PCR 的方法快速诊断甲真菌病,敏感性为 93.33%,特异性为 100%,认为此方法是一种快速、敏感、特异的诊断甲真菌病的方法[20]。虽然这些方法敏感、快速,但仍不能忽视假阳性和假阴性的结果。
        6.2 非扩增的核酸快速检测技术  
       如核酸分子杂交技术,其原理是将具有同源性的两条核酸单链在一定条件下( 适当的离子强度和温度等) 按碱基互补原则退火形成异质双链。此技术可包括RNA印迹技术、DNA印迹杂交和原位杂交等。目前该技术已经应用到感染性疾病诊断及病原微生物的检测中,优点是不但能发现病原菌,还能进行准确定位。荧光原位杂交技术是应用荧光标记的特异核酸探针与原始标本或培养物中的DNA或RNA结合,在荧光显微镜下观察结果。赵晓丽等[21]用达安基因公司合成的白色假丝酵母菌PNA探针与白色假丝酵母菌中特定基因结合,FITC 染色鉴定血培养中白色假丝酵母菌,敏感度为97.5%,特异度为100%。Hyun-Joong Kim等[22]评估了两个28S rRNA定向肽核酸荧光原位杂交(PNA-FISH)探针:P-Ca726(靶向核糖体的新区域)和P-CalB2208(靶向先前报道的区域),将这些PNA探针的性能与针对相同靶区域的DNA探针或DNA探针/辅助组合进行定量比较,结合流式细胞术结果分析表明,PNA探针的杂交质量和产量均高于DNA探针。且P-Ca726具有高度的特异性,对于白色念珠菌来说比P-CalB2208具有高2.5至5.5倍的鉴别能力。这也说明探针的选择对病原体诊断的特异性和敏感性有关。

病原体快速诊断方法学进展

7、病原体蛋白的检测

        不同病原体表面蛋白分子量各不相同。针对不同病原体蛋白质表达谱中的特征谱峰进行分析的基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,如今已经应用到真菌和细菌的快速检测中。许多研究人员已经表明,MALDI-TOF-MS可用于血液培养、脑脊液[23]、尿路感染、呼吸道感染、粪便样品等中的细菌早期鉴定。如有学者[24]运用MALDI-TOF-MS鉴定系统对中段尿样本中的细菌进行直接快速检测,单一菌感染且细菌数大于104CFU/m L的样本检出率达75.5%,两种菌混合感染样本中直接检测出一种优势细菌的检出率达68.7%,质谱直接检测尿液的鉴定结果与单菌落质谱鉴定结果及Vitek 2 Compact鉴定结果完全一致,符合率为100.0%。尽管此方法检测速度快,且无需革兰染色和生化反应的过程,但此技术对病原体的鉴定和分类主要依赖于数据库中现存的质谱图,所以有它的局限性。主要表现在:敏感性低如数量太少的病原菌标本无法检测; 蛋白谱差异较小的病原体难以辨别;数据库中标准的参考图谱不够完善;细胞壁难以破坏的病原体和混合病原体感染的标本等的鉴定能力还不够。但随着技术的发展,MALDI-TOF-MS将会成为一非常有前景的技术。

        综上所述,目前用于病原体快速诊断的方法学种类繁多,每种方法都有它的优缺点,没有哪一种方法能够成为诊断所有疾病的金标准。在临床对疾病的诊断时还是要结合病情和实验室的具体情况,作好检测方法的性能评价,使得检测结果最优化。

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