妊娠期甲状腺功能减退症体内代谢紊乱对后代神经发育的影响研究

　摘要

TSH是诊断甲减最好的指标，TSH诊断标准过低会造成GHT过度诊断，过高会使一些病人不能得到及时治疗，进而对母子产生不可逆的危害。对TSH影响妊娠不良结局等危害的认识在不断变化，它的诊断标准也在不断变化，X甲状腺协会（ATA）2011年的指南建议将2.5 mIU/L作为妊娠期TSH参考值上限，但研究表明以2.5 mIU/L为标准会导致GHT的过度诊断，2017年ATA将建议的妊娠期TSH参考值上限调整为4.0 mIU/L。有研究表明TSH与妊甲减患者体内代谢变化相关，但不同TSH产生的代谢变化对妊娠结局的影响并不十分清楚。

本文以神经发育为例，研究TSH导致的代谢状态改变对妊甲减患者子代发育的影响，期望加深妊甲减体内代谢状态改变对子代发育影响的认识。

　关键词：妊娠期；甲状腺；代谢；神经发育

　1 引言

1.1 研究背景和意义

妊娠期甲状腺功能减退（GHT），简称妊甲减，是妊娠期间由于多种因素导致的甲状腺激素缺乏或生理效应不 足，从而引起的低代谢综合征。妊甲减具有增加流产、早产等妊娠不良结局，引发妊娠高血压、贫血等并发症，影响胎儿的神经智力发育、造成低体重儿、先天畸形等的危害。有研究报道GHT的发生会影响孕妇糖代谢、脂质代谢等代谢状态的改变，这些代谢状态改变会增加妊娠期并发症和胎儿窘迫、新生儿窒息等不良结局的发生率。但妊甲减产生的体内代谢变化对胎儿发育的影响还研究甚少。

1.2 研究内容

本课题首先采集妊甲减和正常妊娠脐带血样品，对其进行核磁代谢组学检测和分析，根据核磁代谢组学分析结果找出TSH相关关键代谢物，查阅关键代谢物代谢通路的代谢关键酶，在脐带血样品中检测代谢关键酶含量和活性的变化，验证找到的代谢物结果。之后在PC12细胞中观察相关代谢物对神经细胞ROS和凋亡的影响，在斑马鱼胚胎模型中观察相关代谢物对子代神经系统、甲状腺、能量代谢等各种发育基因的影响，并在脐带血临床样品中验证这些基因的变化情况。最后得到妊甲减TSH相关代谢物及其对后代神经发育的影响。

　2 文献综述

2.1 妊娠期甲状腺功能减退症概况

　2.1.1 妊娠期甲状腺功能减退症概念及危害

妊娠期甲状腺功能减退（GHT），简称妊甲减，是妊娠期产生的由于甲状腺激素减少或其生理效应不足等原因导致的一种低代谢综合征。许多学者都对妊娠期女性甲状腺功能进行过调查评估，结果因为时间空间的不同妊娠期甲状腺功能减退的发病率也不尽相同，但都表明GHT是发生率最高的妊娠期甲状腺疾病。大量研究表明GHT对妊娠结局和后代发育均会产生不同程度的影响。对孕妇可能会造成流产、早产、死胎，引发妊娠高血压、妊娠糖尿病等不良妊娠结局，对胎儿可能会限制胎儿生长，造成先天畸形或低体重儿等。甲状腺激素对胎儿的发育，尤其是神经系统以及脑的发育十分重要，胎儿的甲状腺系统在孕中期才开始发育，在整个孕期都需要从母体摄取甲状腺激素，因此母体甲状腺激素水平和胎儿的正常发育和生长息息相关，如果孕妇发生甲减，会对胎儿的神经系统发育造成无法挽回的缺陷，影响胎儿的神经智力发育。

　　2.1.2 妊娠期甲状腺功能减退症诊断标准及分类

GHT的主要诊断指标包括TSH、游离甲状腺素（Free thyroxine，FT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（Free triiodothyronine，FT3）、甲状腺过氧化物酶抗（Thyroid peroxidase antibody，TPOAb）。TSH能合成和分泌甲状腺激素，对机体的生长发育以及新陈代谢的调节有促进作用。在发生妊娠时，血清绒毛膜促性腺激素（hCG）的浓度逐渐增加，hCG和TSH有着相似的受体亚单位，hCG对受体的竞争导致TSH的水平下降。发生GHT时甲状腺激素降低，对TSH的负反馈调节受到抑制，导致TSH水平异常升高。2011年XATA建议妊甲减TSH的诊断标准在妊娠早期定为TSH>2.5 mIU/L，妊娠中期和晚期为TSH>3.0 mIU/L。2012我国发布《妊娠和产后甲状腺疾病诊治指南》，其中TSH诊断标准和ATA大致相同，同时指出各地应建立自己的孕期TSH诊断标准。随着研究的深入，越来越多的证据表明TSH>2.5 mIU/L的标准会导致妊甲减的过度诊断[14] [15] [16]，因此2017年XATA将建议的TSH参考值上限调整为4.0 mIU/L，并指出不同地区和人群应建立各自特异性的TSH参考范围。2019年我国新版指南中报道了对一万多例妊娠女性的研究结果，建议将TSH的参考数值定为4.0 mIU/L，也有研究者做了类似研究，结果与指南中的建议一致。

妊娠期雌激素水平大量增加会促进甲状腺素结合球蛋白（TBG）的增加[17]，TBG升高会导致甲状腺素（T4）和三碘甲状腺原氨酸（T3）增加，同时hCG的增加也会使母体T4水平升高，在一系列的反应下，妊娠期FT4水平会提高大约20%。若孕期FT4、FT3水平低于正常值，则需要注意GHT的发生。TPOAb能抑制甲状腺过氧化物酶（TPO） 的活性，TPO在甲状腺激素合成中至关重要，因此TPOAb能影响甲状腺激素的合成。TPOAb也可以检测甲状腺自身免疫是否发生异常。在妊娠早期，胎儿细胞进入母体血液会激活母体免疫系统，释放的免疫细胞会对甲状腺组织以及滤泡结构进行破坏，从而生成特异性TPOAb，使甲状腺激素合成减少，甲状腺出现免疫损伤。因此TPOAb阳性提示有发生甲减的可能。

　2.1.3 妊娠期甲状腺功能减退症治疗方法

目前治疗GHT的常用药物是左旋甲状腺素片（levothyroxine，LT4）。LT4是人工合成的甲状腺激素类药物，该药物进入机体后会转化为T3，进而结合相应的受体，提升血清内FT4和FT3水平，还可有效减少腺垂体分泌TSH，提高交感-肾上腺能系统的功能，改善甲状腺功能。同时LT4不仅能够补充孕妇体内的甲状腺激素水平，还可加快机体新陈代谢进程，改善孕妇的代谢缓慢以及肠壁增厚，加快机体对叶酸的吸收。

我国新版指南推荐妊娠期若发生CH，推荐立即采用LT4进行治疗，直到将TSH控制在妊娠期特异性参考范围的1/2或2.5 mIU/L以下。妊娠期SCH若TSH > 4.0 mIU/L或4.0 mIU/L > TSH >2.5 mIU/L且TPOAb阳性的，推荐给予LT4治疗。IMH患者不推荐也不反对给予LT4治疗，建议查找患病原因如碘缺乏、铁缺乏等，对因治疗。单纯TPOAb阳性患者应每4周检测一次血清TSH，直至妊娠终末期，若单纯TPOAb阳性患者之前有不明流产史的可给予LT4治疗。

虽然LT4是目前公认治疗妊甲减的首选药物，但对于它的有效性尚且没有足够的证据能够证明。大部分研究认为LT4可以改善孕妇妊娠不良结局和并发症，也有研究显示LT4治疗并没有降低妊娠SCH早产、妊娠期糖尿病的发生率 [34]。虽然目前普遍认为LT4治疗的时间越早越好，但治疗时的用量并没有明确的规定，若使用不当可能会产生甲状腺功能亢进症状。有些医生还会考虑治疗的不良反应，因此妊甲减的LT4治疗还需要进一步的研究。

2.2 代谢组学

　2.2.1 代谢组学概述

代谢组学在20世纪90年代首先提出，是反映生物体在内在因素或外界干扰等因素刺激下内源性代谢物变化情况的一门科学。代谢组学能反映病理生理过程中发生过的生物事件，因此在多种领域得到广泛的应用，已成功应用于糖尿病、结肠癌、动脉粥样硬化病等疾病的机制研究中。代谢组学常用的分析技术包括NMR（核磁共振）、GC-MS（气质联用）和LC-MS（液质联用）等。其中最先发展的是NMR技术，它对样本预处理的需求简单、不会破坏样品结构、不需要严格的分析条件、给出的信息量丰富并且能够快速确定代谢物的类型和数量。NMR中最常用的是1H-NMR，它对含氢化合物响应高，能检测出体内大部分的代谢物，并且重复性也好。但NMR技术的灵敏度较低、分辨率也不高、能检测的动态范围有限，对于丰度较低的化合物可能会检测不到。为了弥补这些缺点，研究者们也在积极开发新型高分辨1H-NM。GC-MS主要分离鉴定一些挥发性物质或者含有羟基等极性较强基团的物质，它能快速准确的对代谢物进行定性，但对于不能挥发的动物内源性代谢物需要复杂的衍生化预处理，易引入操作误差。LC-MS的灵敏度高、特异性好，能够对样品进行快速分离，并且不需要经过衍生化，但进行定性分析比较困难。

　　2.2.2 代谢组学在疾病研究中的应用

目前代谢组学已应用于疾病各个方面的研究中，如筛选疾病关键标志物、探究疾病发生的机制、研究药物的毒性等。在疾病代谢组学研究中可以对病人的血清（浆）、尿液、粪便进行检测分析，还可以分析组织和细胞等样品中代谢物的变化。例如应用LC-MS分析乳腺癌患者的血清和尿液、早期冠状动脉粥样硬化病人的血浆等，发现所研究疾病的潜在生物标志物，为疾病的诊断和治疗提供新的思考。孙凌云采用LC-MS对晚期结肠癌患者的血清进行分析，找到了祛邪胶囊发挥抗癌作用可能的机制。Martin-Lorenzo等利用NMR技术对急性冠状动脉综合征患者的尿液进行了分析，发现了可以帮助确定疾病进展、评估疾病风险的代谢标志物。Del Coco等使用1H- NMR对2型糖尿病患者的血清进行分析，找到了2型糖尿病发症患者的生物标志物。

　3 基于1H-NMR对妊娠期甲状腺功能减退症脐带血代谢组学的研究

3.1 引言

脐带血是妊娠期母子间营养交流的载体，可反应母子共同的血液代谢紊乱，常用于代谢组学研究中。本章首先用1H-NMR对脐带血进行检测分析，同时为了更好的研究不同TSH之间的差异，对TSH进行细分，以TSH值0-1、1-2、2- 3、3-4和>4分为5组进行分析，得到TSH相关关键代谢物。之后根据妊甲减其他诊断指标，分别以SCH（TSH>4，FT3、FT4正常）、IMH（TSH正常，FT4低于正常值）、TPOAb阳性（TSH正常，TPOAb高于正常值）分组分析，对TSH相关关键代谢物进行正向和反向的验证。最后对差异代谢物进行代谢通路分析找到代谢关键酶，在脐带血样品中检测关键酶含量和活性的变化，进一步验证TSH相关关键代谢物的准确性。

3.2实验材料和仪器

表3.1 实验试剂和仪器

3.3 实验方法

　3.3.1 脐带血制备

取出冻存脐带血，解冻后取450 µL到离心管中，加入350 µL磷酸缓冲溶液（含有10%重水和0.01%TSP），充分混匀后离心20 min（4℃，13000 r/min），取600 µL上清液到5 mm核磁管中。

3.3.2 1H-NMR检测条件

制备好的脐带血样品在600 MHz 核磁共振光谱仪上测试，工作频率为600.13 MHz，温度为298 K，采用CPMG脉冲序列，谱宽为12345.679 Hz，脉冲宽度14，1.0 s延迟时间，扫描64次，采样时间5 min。

　3.3.3 不同分组的1H-NMR图谱处理和分析

按照不同的分组把脐带血1H-NMR图谱导入MestReNova软件，并依次对基线和相位进行调整，以TSP内标位移δ 0.0）对图谱进行位移校准。叠加所有核磁图谱，移除图谱中δ2.52~2.80、δ3.08~3.32、δ3.61~3.70和δ4. 70~5.20区段，消除EDTA和水信号的影响，接着以0.01为积分单位，对图谱中δ0.80~8.50的区域进行分段积分并进行峰面积归一化处理，处理好的数据保存进行后续分析。

将数据导入SIMCA-P 14.1软件进行多元统计分析，采用PCA对所有样本的图谱数据进行数据简化呈现，反映样本数据的原始分布状态，使用Hotelling’s T2去异常值法对样本进行去异常处理，去掉超出99 %置信区间的异常样本。接着使用PLS-DA分析组间差异，通过排列验证实验进行模型验证，验证次数200次。继续通过OPLS-DA判断两组间的差异代谢物，并再次进行模型验OPLS-DA分析使用par标度化方法，筛选得到VIP>1，同时满足独立样本t检验P<0.05条件的差异位移，结合文献以及HMDB（http://www.hmdb.ca/）等数据库对差异位移进行归属，最后得到差异代谢物。

3.4 讨论

本章采用1H-NMR对脐带血进行检测并以不同TSH值分组进行分析，结果得到脂质、亮氨酸、缬氨酸、乳酸、柠檬酸、谷氨酰胺、葡萄糖醛酸和葡萄糖8种差异代谢物。之后根据妊甲减其他诊断指标，对TSH相关关键代谢物进行验证。其中SCH分组TSH>4、FT3和FT4正常，得到的葡萄糖、乳酸和TSH分组中变化趋势相同，正面验证了TSH相关关键代谢物的准确性。IMH分组TSH正常、FT4低于正常值，得到葡萄糖和TSH分组中变化趋势相反，反面验证了TSH相关关键代谢物的准确性。TPOAb阳性分组TSH正常、TPOAb高于正常值，得到的谷氨酰胺和TSH分组中变化趋势相反，亮氨酸和葡萄糖和TSH分组中变化趋势相同，可能原因是亮氨酸和葡萄糖的变化受到TSH和TPOAb的共同影响，也可能是入组样品数量有限且临床样品间差异较大引起的。

　4 DCF法检测细胞ROS水平

将处于对数生长期的PC12细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板中，每孔100 µL，最外层的孔加入PBS封闭，放进细胞培养箱中培养24 h。24 h后换液，设置对照组和MNLC、1/3MNLC、1/10MNLC的代谢物组，每组重复6个孔，24 h后根据活性氧检测试剂盒说明书操作。每个实验至少重复3次。

4.1 Hoechst法检测细胞凋亡

将处于对数生长期的PC12细胞以4×105/孔的密度接种于6孔板中，放进细胞培养箱中培养24 h。24 h后换液，设置对照组和MNLC、1/3MNLC、1/10MNLC的代谢物组继续培养24 h。根据说明书操作，最后在荧光显微镜下观察细胞并拍照，每孔分别在四角和中间随机选取一片视野进行拍照，其中细胞核呈致密浓染且颜色发白的为凋亡细胞，计算视野内凋亡细胞比例。每个实验至少重复3次。

4.2讨论

TSH相关代谢物对神经细胞PC12细胞的影响，首先研究各个代谢物对PC12细胞的毒性，找到各个代谢物对PC12细胞的MNLC，接着观察代谢物对细胞内ROS水平和细胞凋亡情况的影响。ROS主要来自线粒体和质膜，具有促进细胞有丝分裂，诱导细胞增殖等的作用。但当ROS大量累积会使细胞发生氧化应激，氧化破坏细胞内大分子的正常功能，进而造成细胞增殖阻滞、衰老、凋亡和坏死等。当ROS水平非常低时也会使细胞产生增殖抑制[61]。在我们的实验中代谢物进行干预后PC12细胞的ROS水平有显著的变化，亮氨酸、葡萄糖醛酸、乳酸呈剂量依赖性的降低PC12 细胞内的ROS水平，葡萄糖、柠檬酸、缬氨酸、谷氨酰胺呈剂量依赖性的增加PC12细胞内的ROS水平，这可能对PC12 细胞的增殖和凋亡产生影响。凋亡是细胞为了更好的适应生存环境主动选择的一种死亡，由基因进行控制。细胞凋亡在清除过多的细胞、胚胎组织器官的分化等方面发挥着巨大的作用。正常的凋亡对于神经系统的分化、一些器官的发育以及维持细胞数量的动态平衡等十分重要[62]。非正常的细胞凋亡可能会造成一系列的疾病，凋亡水平过高和过低都会导致细胞、组织等出现病态的退化或增殖[63]。在我们的结果中葡萄糖、缬氨酸和谷氨酰胺都显著增加细胞的凋亡率，其他代谢物对凋亡的影响并不显著，这和前面ROS水平的结果相对应，说明TSH相关的代谢物对神经细胞的ROS水平和凋亡有影响。

　总结

本课题以神经发育为例，研究了TSH相关代谢状态的改变对后代神经发育的影响。首先采用1H-NMR代谢组学技术对产妇的脐带血进行检测，以不同的TSH数值进行分组分析，确定了7种TSH相关的代谢物，分别是亮氨酸、缬氨酸、乳酸、柠檬酸、谷氨酰胺、葡萄糖醛酸和葡萄糖。同时以妊甲减不同诊断指标进行分组分析，验证了TSH相关关键代谢物的准确性。接着对各组找到的代谢物进行代谢通路分析，确定谷氨酰胺合成酶（GS）和组氨酸解氨酶（HAL）两个代谢关键酶，通过ELISA等检测脐带血样品中关键酶含量和活性的变化，结果和代谢组学分析中代谢物的变化趋势相同，进一步对TSH相关关键代谢物进行验证。

　致谢

无情的时光老人就像一阵风，在我们不经意之间带走了2021年，迎来了一个不平凡的2022年，同时也迎来了我们学生时代的尾声。时光匆匆，岁月苍苍，生活就像昨天一样，同学朋友的笑声，还在我耳边回荡。不久，我们就要加入社会，离别时刻，只有感恩与深深地不舍。

正值毕业时刻，我要向那些陪伴我们时光的老师表达深深地谢意。他们的栽培与教诲，是我们一生的财富与瑰宝，值得我们珍藏。我们遇到问题时，想起了老师的教诲，便不会轻言放弃，对知识学要问追根究底，去深层次的解读，一切的感激与不舍难以言说。不仅如此，我们还在老师们的身上看到了做人的基本要求，要严于律己，以身作则，他们为我们树立了好榜样，我们要积极向他们看齐。

最后，我要感谢那些默默帮助过我的同学、朋友和家人，给了我很多帮助，给予了很多温暖，在年时光中，收获了那么多的东西，谢谢你们的陪伴，谢谢你们的支持与理解，人生有缘再会，最后祝你们一切顺利，万事顺意！

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妊娠期甲状腺功能减退症体内代谢紊乱对后代神经发育的影响研究

价格 ¥9.90 发布时间 2023年9月26日

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