富血小板血浆对糖尿病大鼠溃疡创面愈合的影响及机制探讨

　　摘要

目的糖尿病继发性溃疡是影响糖尿病患者预后转归及生存质量的主要并发症之一，基础实验及临床试验已经证实富血小板血浆在糖尿病溃疡创面愈合过程中能发挥积极的作用，促进伤口愈合，但相关机制仍不甚明确。已有研究表明，血小板血浆中含有多种生长因子，其与促进伤口愈合密切相关，但具体作用机制尚不清楚。本实验旨在观察富血小板血浆对糖尿病大鼠溃疡创面的作用并试图阐明其具体作用机制。

方法选用20只6周龄健康SD大鼠，性别选取雄性，喂养富含高脂肪、高糖的特殊饲料，采用STZ注射方式。用这些手段来构造大鼠的疾病模型，该疾病模型为糖尿病动物模型的常规制备方法。成模之后再在糖尿病大鼠身上构建皮肤溃疡模型。糖尿病大鼠溃疡模型成功制备后，随机纳入为对照组和实验组，对照组创面予以0.9%生理盐水涂抹，实验组大鼠予以富血小板血浆涂抹。分别在干预后第3、7、14天这3个时间点，肉眼观察、记录溃疡创面的恢复情况，利用相机拍摄创面，采用图像面积测算软件，自动算出创面面积以及创面愈合率等数据。创面及创缘取材行HE染色观察创面组织的病理学改变；ELISA法检测溃疡组织TGF-β1、MMP-2和TIMP-2的表达变化，绘制表达水平曲线图。运用SPSS22.0软件处理得到的实验数据，并进行统计学分析。以P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

　　结果

（1）创面愈合情况：在干预后的相同时间点，实验组创面渗液、肿胀程度以及炎性反应均较对照组创面要轻，同时，实验组创面色泽相对更红润，创面及创缘上皮化迹象也要更明显。

（2）创面愈合率：分别在实验的第3、7、14这三个时间点测算，其中在这三天实验组得到的结果都比对照组高。在第三天，两组的数据差异没有统计学意义。（P＞0.05）；干预后第7、14天，两组之间的差异显著，有统计学意义（P＜0.05）。

（3）创面组织病理学观察：HE染色显示，在相同时间点，实验组创面成纤维细胞和新生微血管较对照组数目更多，而伴随炎性反应较对照组更轻。

（4）创面组织中TGF-β1，以及MMP-2，还有TIMP-2蛋白的表达：ELISA显示，在第三、七、十四天取得的材料中，实验组MMP-2水平低于对照组（P﹤0.05），TGF-β1、TIMP-2含量均高于对照组（P＜0.05）。

　　结论

（1）利用制作全层皮肤缺损＋滴入金葡菌菌液的方法可以成功地制造糖尿病皮肤溃疡模型。

（2）富血小板血浆对糖尿病大鼠溃疡创面进行干预后，创面组织新生血管形成、成纤维细胞增殖明显活跃，溃疡创面愈合率也明显提高，同时可预见愈合时间缩短。

（3）富血小板血浆促进糖尿病大鼠溃疡愈合的机制可能与TGF-β1活化表达水平增加，在抑制MMP-2同时促成TIMP-2，通过调节MMP-2／TIMP-2的相对表达水平来调节基质的合成和降解，进而促进组织愈合有关。

关键词：富血小板血浆（PRP），糖尿病溃疡创面，创面愈合，转化生长因子β1（TGF-β1），基质金属蛋白酶2（MMP-2），组织金属蛋白酶抑制物2（TIMP-2），机制研究

　　第一章绪论

　　1.1课题来源、研究目的和意义

随着社会工业化进程的推进，人类的生活工作习惯、方式也发生了巨大的改变，糖尿病悄然已成为全球范围内发病率急剧上升的主要代谢性疾病之一[1,2]。据国际权威数据，截至2017年，全球已有4.25亿糖尿病患者[3]，而我国的糖尿病患病人数目前超过1亿，占全球25%，其中超三分之一患者合并严重糖尿病神经、血管病变，糖尿病溃疡发生率很高，轻者引起组织坏死，迁延不愈，重者发展成为骨髓炎、肢体坏疽，病情危重者危及生命，成为临床工作诊治的重点和难点[4]。糖尿病溃疡患者多合并周围神经，血管病变，影响局部组织的血液循环和组织灌注，三者共同作用造成创面愈合困难。既往研究显示，多种病理过程参与糖尿病溃疡的发生和发展，包括氧化应激、炎性反应失衡、特殊菌感染、生长因子缺乏等，但目前仍无统一定论[5]。目前糖尿病溃疡的主要治疗方法包括清创、换药、改善血循环、开通闭塞血管等[6]，但治疗效果不尽理想，截肢率仍较高，预后较差，加上巨额的医疗负担，患者不仅要承受身体上的痛苦，还要承受心灵的巨大压力。所以，为了解决上面的问题，新的医治方案显得越来越有必要，以使溃疡创面治疗多元化[7]。富血小板血浆（Platelet-richplasma，PRP）从被提出到现在，已应用在骨科、烧伤整形科等，临床疗效显著[8]，之后又被研究并应用于糖尿病性溃疡的治疗，经一些基础及临床研究证实，富血小板血浆可促进组织修复、创面愈合，但其具体作用机制仍不甚清楚，是目前临床研究的热点之一[9]。本实验旨在通过建立糖尿病大鼠溃疡模型来观察富血小板血浆对溃疡创面愈合的影响，并探索其相关机制，为验证临床使用富血小板血浆的有效性与安全性提供更多的理论依据。

　　1.2国内外研究概况

1.2.1国外研究概况

糖尿病溃疡创面愈合涉及炎性反应失衡、特殊菌感染、生长因子缺乏等多种特殊病生理过程，近些年研究逐渐表明，生长因子缺失是造成糖尿病溃疡病变迁延不愈的重要因素之一。生长因子是一类重要的、具有多效应的分子，它在调节细胞增殖、迁移、分化以及信号转导等方面扮演重要的作用。BennettS等人的研究发现，在糖尿病创面愈合的各个阶段，生长因子均有不同程度的减少[10]，TsangM研究发现在糖尿病溃疡创面多种生长因子之间含量下降或比例失衡与创面修复异常相关[11]。进一步研究发现，不同生长因子在创面愈合中发挥的作用各异。AktasS对34例糖尿病足部溃疡的患者局部应用重组人表皮生长因子，结果发现溃疡愈合速度显著提高，创面再上皮化水平较对照组明显增加[12]。Singla等同样将重组人表皮生长因子用于糖尿病溃疡患者并证实其有效性[13]。DumantepeM等研究亦证实了其治疗的有效性和安全性[14]。另有纳入294例患者的RCT研究结果显示，创面经重组人表皮生长因子干预治疗后，创面愈合速度得到了提高。LiuY等人的研究结果显示，在糖尿病患者体内，当TGF-β1的含量下降后，溃疡创面将需要更长的时间去恢复。当TGF-β1>115pg/ml时，溃疡可能会在3个月内消失。[15]。MaioneA等研究结果提示糖尿病溃疡患者，成纤维细胞会跟TGF-β1产生反应，这将导致组织愈合时间延长。[16]。上述研究说明，在慢性溃疡创面组织中多种生长因子缺乏是影响组织愈合的重要因素。血小板内含有多种生物活性物质，其中包括多种生长因子，活化后的血小板发生颗粒释放作用，能快速释放这些生长因子进而参与创面的愈合[17]。富血小板血浆是新鲜外周全血经多次分离、浓缩后得到的浓度高于血小板基线浓度3-7倍的血浆及浓缩物，使用时通常与一定比例凝血酶-钙剂混合后得到胶状物，即PG凝胶，原理是加入了该剂后能激活血小板，加速其释放生长因子等活性物质，进而快速地在局部创面发挥作用。已有研究表明用这种凝胶覆盖创面可以有效地促进溃疡创面的愈合，并已被广泛应用于骨科、口腔颌面科等临床科室[18]，且取得了较好的疗效。Driver等通过制备富血小板血浆治疗糖尿病溃疡创面患者，结果发现与常规方法组相比，平均愈合时间缩短了4.5天[19]。O’Connell等应用富血小板血浆治疗难治性慢性下肢溃疡患者，结果显示经过7周后，三分之二患者完全愈合[20]。说明富血小板血浆可用于糖尿病溃疡病变的治疗，促进溃疡创面的愈合，涉及其中机制的研究较零散，尚未成体系，因此具体机制仍不甚明确。

溃疡组织通常经过炎症期、增生期和重塑期，在多种局部细胞因子的相互作用下逐渐愈合。其中，蛋白酶水解是溃疡创面愈合过程中的重要一环[21]。RaffettoD在关于溃疡愈合的综述中提到转化生长因子TGF-β，还有基质金属蛋白酶-2（MMP-2），以及基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）在愈合伤口过程中起核心调节作用[22]。Liotta首次在动物移植肿瘤的培养液中发现MMP-2[23]，随着研究的深入发现MMP-2能降解血管壁基底膜中的Ⅳ型胶原并稳定的存在于伤口愈合的阶段。TIMP-2是特异性基质金属蛋白酶抑制因子，多项研究证实TIMP-2能抑制MMP-2，并参与溃疡组织细胞增生、血管形成等，因此MMP-2/TIMP-2表达平衡与溃疡组织愈合有着不可分割的联系[24]。MMP-2发挥促进组织基质降解的作用，而TIMP-2发挥抑制作用，当二者之间的平衡被打破，会造成组织基质非正常性累积，进一步造成伤口痉挛，Kandalam团队在针对缺乏TIMP-2的小鼠的一项研究中发现，当诱发此类小鼠发生心肌梗死后发现心肌细胞胶原密度明显下降同时结构紊乱，进一步研究发现该类小鼠MMP-14活性增加，研究认为TIMP-2可以通过抑制MMP-14来调节基质蛋白水解[25]。Takawale等亦通过心脏缺血再灌注损伤模型研究证实上述研究论点[26]。在创面愈合过程中，MMP-2相对表达平稳，因此研究的相对较为充分。有研究发现，慢性溃疡病变渗出液中MMP-2、MMP-9浓度高，而TIMP-2水平较低。Lobmann等对比了糖尿病及非糖尿病患者溃疡创面中MMP-2、TIMP-2的表达，结果显示糖尿病足溃疡创面中MMP-2是非糖尿病足溃疡患者的3倍，而TIMP-2的表达则减少近2倍，进一步证实MMP-2与TIMP-2的失去控制，这将延长组织愈合的时间。当TIMP-2在人体内的含量减少时，MMP-2的活性将增高，两者将会失去控制。细胞基质水解作用增强，造成炎性细胞浸润，病变经久不愈[27]。在这二者之间，扮演调控作用的主要是TGF-β1。人体TGF-β主要来自于血小板、巨噬细胞等，包括3种亚型，三者之间高度相似性。Weber等通过对比正常皮肤和慢性溃疡皮肤，检测组织中TGF-β水平，结果发现慢性溃疡组织中检测出TGF-β1、2高表达[28]。富血小板血浆活化后高表达TGF-β等生长因子，同时研究发现富血小板血浆能够促进OLETF模小鼠高表达MMP-2、MMP-9[29]，但目前具体研究通路仍有待进一步研究证实[30]。

综上所述，TGF-β1、MMP-2、TIMP-2的表达水平共同参与影响了溃疡伤口的愈合，富血小板血浆活化后可释放TGF-β1，研究这些分子对于糖尿病溃疡的作用，这是富血小板血浆治疗的主要理念，这项研究将为临床解决糖尿病足溃疡开出新的道路。为糖尿病溃疡的治疗开辟一条新途径。

1.2.2国内研究概况

查阅文献得出，[31]，我们国家50岁以上的糖尿病患者，在患病1年内，他们的足溃疡的发病率为8.1%。治愈后的患者，在1年内的复发率为31.6%。糖尿病溃疡属中医“脱疽”、“疮疡”范畴，结合传统医学开展的临床研究相对较多[32]，富血小板血浆治疗糖尿病溃疡创面仍处于临床研究阶段，尚未大规模应用于患者。国内既往研究多着重于糖尿病溃疡难以愈合的机制研究。孙梦菊等的研究发现糖尿病溃疡，糖尿病足溃疡伴感染患者MMP-2高表达，而TIMP-2低表达，同时感染细菌种越多、溃疡级别越高，MMP-2升高越明显，MMP-2/TIMP-2比值越高[33]。叶林等研究结果同样表明在糖尿病足溃疡并感染患者中，MMP-2、MMP-2/TIMP-2明显升高，提示在溃疡创面愈合过程中，MMP-2与TIMP-2之间的平衡对组织修复、创面愈合至关重要[34]。目前对于富血小板血浆治疗糖尿病溃疡针对MMP-2通路的研究较少。李兰[35]等学者，检测糖尿病患者在治疗后15内的MMP-2，以及TIMP-2，还有TGF-β1浓度变化，比较这些指标与治疗前数据。结果发现，MMP-2在应用治疗方案后，在人体内的含量下降，TIMP-2、TGF-β1在人体内的含量则上升了，MMP-2/TIMP-2比值降低，TGF-β1与MMP-2/TIMP-2呈负相关。提示富血小板血浆可能通过TGF-β1参与MMP-2/TIMP-2通路表达而发挥作用，但仍需基础实验进一步证实。

　　1.3论文的主要研究内容

本研究选用20只6周龄健康SD大鼠，性别选取雄性，喂养富含高脂肪、高糖的特殊饲料，采用STZ注射方式。用这些手段来构造大鼠的疾病模型，该疾病模型为糖尿病动物模型的常规制备方法。之后采用制作皮肤缺损＋滴入金葡菌菌液的方法在糖尿病大鼠身上模拟构建糖尿病溃疡模型。糖尿病溃疡大鼠成功建模后，随机纳入对照组和实验组，对照组创面予以0.9%生理盐水涂抹，实验组大鼠予以富血小板血浆涂抹。分别于干预后第3、7、14天肉眼观察两组溃疡恢复情况，采用图像面积测算软件，自动算出创面面积以及创面愈合率等数据；在在这三个时间节点，在创面的边缘取出所用的材料。一部分用于进行HE染色，观察创面组织形态学变化；另一部分用于ELISA法检测溃疡组织TGF-β1、MMP-2和TIMP-2表达水平，绘制表达水平曲线图。将采集到实验数据输入SPSS22.0软件进行统计学处理并分析。

　　第二章材料与方法

　　2.1实验材料

2.1.1实验动物

选用20只健康SD大鼠，性别选取雄性，年龄在6周左右，体重在160-220g内，这些大鼠都从君科生物公司采购，该公司位于南京。许可证号：SCXK（苏）2017-0005。在所有的研究期间，大鼠被饲养于××大学实验动物中心。饲养环境符合标准。高糖高脂饲料购于上海锐赛生物技术有限公司，其中基础饲料67.5％，白糖20％，猪油10％，蛋黄2.5%。

2.1.2主要试剂

富血小板血浆对糖尿病大鼠溃疡创面愈合的影响及机制探讨

2.1.3主要仪器

富血小板血浆对糖尿病大鼠溃疡创面愈合的影响及机制探讨

2.1.4主要试剂配制

（1）柠檬酸缓冲液的配制

先取柠檬酸钠，质量为2.94g；再加双蒸水100ml，用玻璃棒进行搅拌，让柠檬酸钠完全溶解，制成柠檬酸钠溶液，用标签计为A液。再去柠檬酸，质量为2.10g，再加双蒸水100ml，用玻璃棒进行搅拌，让柠檬酸完全溶解，制成柠檬酸溶液，用标签计为B液。然后将A液和B液混合，比例为1:1.32，也就是配制100ml混合液，A液取43ml，B液取57ml。这样用作缓冲的柠檬酸溶液就做好啦，其浓度为0.1ml/l。（100ml）（pH4.0-5.0）。

（2）链脲佐菌素（STZ）溶液的配制

在使用前，取适量的降温柠檬酸溶液，将一定量的STZ粉末放入其中，制成STZ溶液，浓度为10mg/ml，调整溶液PH，让PH维持在4.5。注意操作的安全问题，STZ溶液的制作需在避光条件下和冰台上操作，且现配现用。

（3）PBS（pH7.4）液的配制

称取磷酸二氢钾，质量0.24g；磷酸氢二钠，质量1.44g；氯化钠，质量8g；氯化钾，质量0.2g；加去离子水，800ml；用玻璃棒进行搅拌，然后调节PH，用浓盐酸调节，让PH维持在7.4，最后，定容为1L。

（4）10%中性福尔马林固定液的配制

取无水磷酸氢二钠，质量为6.5g；磷酸二氢钠一水化合物，质量为4.0g；在广口瓶中加入900ml蒸馏水，用玻璃棒进行搅拌，在倒入100ml甲醛溶液，甲醛溶液的浓度为40%，震荡广口瓶。溶液制作完成后，将溶液密封，同时遮蔽阳光。

（5）柠檬酸葡萄糖溶液（ACD抗凝剂）的配制

称取0.48g柠檬酸溶入50ml双蒸水，配成柠檬酸溶液，即为A液；柠檬酸钠溶入双蒸水中，柠檬酸钠用1.32g，双蒸水用50ml，制成柠檬酸钠溶液。标记为B液。将A液和B液等比例进行混合，再放入葡萄糖干粉于混合溶液中，干粉质量1.47g，得到ACD抗凝剂（100ml），避光保存备用。

　　2.2实验流程与方法

2.2.1糖尿病溃疡模型的制备

（一）建模前动物饲养

20只６周龄SD雄性大鼠（购自南京君科生物工程有限公司）给予普通大鼠特殊饲料饲养，饲养时间1周，在饲养期间，观察小鼠的各项体征，像毛发色泽，还有精神状态，另外还有饮食情况，并将体征健康的大鼠随机纳入实验。纳入实验的大鼠继予高糖高脂饲料进行喂养，其主要组成成分为基础饲料67.5％，白糖20％，猪油10％，蛋黄2.5%。期间仍需观察大鼠体征、精神状态等有无异常。在整个实验过程期间，所有大鼠分笼饲养，均自由进食、自由饮水。饲养条件：室温24±2℃，相对湿度50%±10%，饲养室定期消毒，室内通风状况良好。

（二）糖尿病大鼠模型的制备

（1）纳入实验的大鼠均给予高糖高脂饲料进行喂养，持续4周；

（2）喂养4周后，所有的大鼠提前禁食，禁食时间为12小时，禁食期间满足小鼠的饮水。然后，测量空腹小鼠的体重，再腹腔注射1%链脲佐菌素溶液，也就是STZ，注射剂量按照30mg/kg进行计算。

（3）3日后取尾静脉血测大鼠随机血糖值；

（4）若随机血糖值≥16.7mmol/Ｌ，则大鼠疾病模型制作成功，也就是糖尿病模型成立。若血糖值不满足条件，再对小鼠禁食12小时，然后继续注射链脲佐菌素溶液，剂量按照10mg/kg计算，若还是不满足条件，则放弃该大鼠。

（三）糖尿病大鼠溃疡模型的制备

（1）器械消毒：将止血钳、镊子、剪刀等手术器械放入盛有500ml的10%新洁尔灭溶液的烧杯中浸泡8-10小时，然后高温消毒。

（2）称重：将空笼放置在电子天平上称重，待数值稳定归零后，迅速将大鼠放入空笼中，读取此时电子天平的数值并记录。

（3）麻醉：采用腹腔注射7%水合氯醛的方法对制备成功的糖尿病大鼠进行麻醉，一般剂量为0.5ml/100g，麻醉剂根据麻醉情况可适当追加。

（4）创面制作及包扎：待确认麻醉效果满意后，去除大鼠背部的皮毛，工具为递须刀，将毛发脱净后，用75%无水乙醇擦掉剩余的脱毛膏。将提前准备好的边长为2cm的正方形硬纸板放置于大鼠后背，用标记笔沿着正方形纸板做一个正方形标记。然后，将大鼠固定，固定位置为手术操作台，造模前常规消毒，使用无菌手术器械沿着标记线切开皮肤及皮下组织，制造深达筋膜层的皮肤创面，深筋膜及以下组织予以保留，再用细组织剪刀对伤口周缘略作修剪。将制作好的全层皮肤缺损予以充分暴露，滴入金黄色葡萄菌菌液（6×1012/L）1ml至创面。至此，糖尿病大鼠溃疡模型制备的步骤已基本完成。将无菌敷料覆盖于创面上，用手术线将敷料四周缝合于大鼠皮肤，对应创面处剪一“凹”型形状，并用自制项圈固定大鼠颈部，以便于观察创面的进展情况。在手术完成后，将每只大鼠单独饲养，满足其饮水和饮食的需求，每天更换两次垫料，清洗笼具。术后大概第3天，各大鼠创面皮肤颜色晦暗，创面及周围有红肿、皮温升高，创面可见组织坏死，或脓性分泌物，或坏死黑痴，用大头针刺创面5mm无出血，即表示溃疡模型成立。

2.2.2富血小板血浆（PRP）的制备

（1）每次另取2-3只健康雄性大鼠予7%水合氯醛（0.5ml/100g）注射麻醉，麻醉剂根据麻醉情况可适当追加；

（2）直视下用预先肝素化的5ml注射器及一次性静脉采血针经大鼠腹主动脉穿刺取得全血约10ml；

（3）从取得的全血中各取出1ml，通过全血血细胞分析仪行血小板计数测定；

（4）准备好含有ACD抗凝剂的离心管，抗凝剂剂量为15ml，将余下的9ml血液注入离心管内，对混合液进行离心管，离心管条件为200×g、4℃。

（5）在上面的离心管过程结束后，混合液将分为3层，取另一干净的离心管，将混合液的上清液和交接面层转移到新的离心管中。进行第二次离心管，离心条件为500×g和4℃，时间为10分钟。结束后，去掉上层的贫血小板血浆(PPP)，就可以得到我们需要的下层液(PRP)，它的成分包含极少的红细胞，还有血浆，另外还有血小板混合物。

（6）使用PRP进行组织修复或创面治疗时，通常将PRP和凝血酶-钙剂混合，比例为10：1。混合液在自然的凝固后，就变成了所需的PG凝胶。凝血酶-钙剂的配制：称取无水氯化钙10g，加入100ml蒸馏水，玻璃棒搅拌至完全溶解，配成10%氯化钙溶液。取出1ml氯化钙溶液，与牛凝血酶（1000U）混匀，即得血小板激活剂。

2.2.3分组与干预

将造模成功的实验大鼠随机地纳入对照组和实验组，对照组创面予以0.9%生理盐水1ml均匀涂抹，实验组创面予以PRP1ml均匀涂抹，随后两组创面均先以凡士林纱布覆盖，再予无菌纱布覆盖并包扎固定。完毕，所有大鼠均送回继予单笼饲养并编号。之后，两组创面均予以隔日换药，换药时各创面处理步骤一致，即先以络合碘擦拭消毒再以无菌纱布擦干后常规包扎固定。

2.2.4样本获取

分别于干预后第3、7、14天，将取材用大鼠称重，予7%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后，切取创面及创周5mm内皮肤组织，随机取一块组织用PBS液清洗组织表面的污渍后浸泡固定于10%的中性甲醛中，后续行常规HE染色，光镜下观察愈合情况；剩余组织用PBS液清洗组织表面的污渍后分装于2mlEP管内放置－80℃冷冻保存，后续行各组大鼠创面组织TGF-β1、MMP-2和TIMP-2蛋白表达的ELISA检测。

2.2.5观察指标

2.2.5.1一般情况观察

观察两组各糖尿病大鼠一般情况，包括精神状态、进食量、饮水量、排泄量等变化，并与正常健康大鼠作比较。

2.2.5.2创面愈合情况观察

先肉眼观察溃疡创面，得到肉眼的大体观，从多方面评估不同组的溃疡创面的情况，观察新生的肉芽组织和创面的炎症情况，这些评价指标有创面渗液量，还有肿胀程度，另外还有色泽。用数码相机拍摄创面的图片，将得到的图片放入Image J，一款用于图像分析的软件，长用来测算面积。这里用来测算创面的面积。将设计好的公式输入进软件，从而得到创面愈合率，将这个愈合率作为评价指标。计算公式：创面愈合率＝[（初始创面面积-当前创面面积）／初始创面面积]×100％。

2.2.5.3创面组织病理观察

分别从干预后第3、7、14天取得的创面及创周组织样本中，取出一小块予HE染色，观察不同时间点各组创面愈合的病理学情况。

H-E染色法的具体操作步骤：

（1）将取得的待检组织放入10%的福尔马林中石蜡中包埋，切组织厚度5mm；

（2）脱蜡：二甲苯Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min、二甲苯Ⅲ5min；

（3）水化：100%乙醇Ⅰ浸泡5min、100%乙醇Ⅱ浸泡5min、95%乙醇Ⅰ浸泡3min、95%乙醇Ⅱ浸泡3min、85%乙醇浸泡3min、75%乙醇浸泡3min、蒸馏水冲洗5min；

（4）染色：苏木精染料浸泡，时间10-15min、蒸馏水冲洗，时间5s、盐酸酒精分化液，时间10s，蒸馏水冲洗，时间30s，镜检、自来水冲洗，时间10min，蒸馏水冲洗，时间5s，0.5%伊红染料，时间1-3min、蒸馏水冲洗，时间5s，95%乙醇Ⅰ，时间3min，95%乙醇Ⅱ，时间3min，100%乙醇Ⅰ，时间5min，100%乙醇Ⅱ，时间5min，二甲苯Ⅰ，时间5min，二甲苯Ⅱ，时间5min，二甲苯Ⅲ，时间5min；

（5）封片：擦干剩余的二甲苯，滴中性树脂胶封片。

2.2.5.4创面组织TGF-β1、MMP-2和TIMP-2的ELISA测定

将干预后第３、7、14天切取的溃疡创面组织剩余部分，从－80℃冰箱取出，将取出的标本融化，融化后，标本的需要保持一定的温度，温度为2-8℃。将标本放入PBS中，PBS的PH为7.4，将标本与PBS混合均匀，采用工具匀浆器。然后对混合液离心，离心条件为3000r/min，时间为20min。收集离心后的上清液。在进行Elisa实验操作时，所有试剂盒应提前取出，放在21至26℃的室温中15至30分钟。操作的流程以及指标参考试剂盒说明。

2.2.6统计学处理

对数据进行统计学分析。工具为SPSS22.0，一款数据分析软件。数据资料符合正态分布的，用均数±标准差（±s）表示，不符合者用中值[四分位数间距，M(QR)]表示；对于相同时间点得到的数据，组间采用独立样本t检验的方法，对两组进行比较。对于不同时间点得到的数据，组间采用非参数Mann—WhitneyU的方法，对两组进行比较。P＜0.05认为差异有统计学意义。

　　第三章结果

　　3.1建模情况

就血糖水平来看，正常大鼠的血糖浓度远低于糖尿病大鼠。正常大鼠、糖尿病大鼠（n=18）的血糖分别为：5.06±0.78mmol/L、25.54±1.63mmol/L。糖尿病组大鼠仅2只血糖未达到成模标准，未对其数据进行统计学处理。溃疡创面过程中，实验组（n=9）大鼠一般状况良好，有三只中途死亡，故未对其数据进行统计学处理。

　　3.1大鼠一般情况

糖尿病大鼠精神状态稍萎，毛发无光泽、皮毛粗糙，皮脂变薄，逐渐出现多饮、多食、多尿、活动减少等症状，体重较造模前有所减轻。正常健康大鼠精神良好，皮毛光亮，皮脂丰厚，进食饮水正常，活动灵敏，体重渐增加。

　　3.2创面大体情况

实际建立的溃疡面积与模板面积基本一致。

（1）干预后第3天，实验组与对照组溃疡创面均有脓性渗出液，对照组较实验组渗出更重，且干燥结痂，结痂下有脓液淤积。两组创面均见不同程度的肿胀，且对照组较实验组稍重。两组溃疡边缘均尚未见上皮化迹象。

（2）干预后第7天，实验组未见明显脓性渗出，对照组的创面有脓性渗出，少量的创面被坏死组织遮盖，色素在创面的边缘出现。实验组明显不同，创面肿胀程度下降，对照组的创面稍肿胀。实验组见新生肉芽组织，创面鲜红，对照组肉芽增生不明显，创面颜色较实验组更淡。两组创面创缘不规则，开始有上皮化迹象，且实验组较对照组更明显。

（3）干预后第14天，实验组创面无明显肿胀及渗出，肉芽组织生长活跃，呈红色，创面缩小，伤口被肉芽组织填充，创面趋于愈合；对照组创面仍有少量渗出，脓液干燥结痂，覆盖于创面，且创面表面色素沉着，基底部隐约见肉芽组织初步形成，但创面创缘上皮化迹象不甚明显。

　　3.3创面愈合率

干预后第3天，实验组创面愈合率高于对照组，但两组数据，P大于0.05，提示两组愈合情况的差异无统计学意义；第7、14天，比较创面愈合率指标，实验组数据大于对照组，，同时，两组数据，P小于0.01，提示得到的数据具有统计学意义。PRP干预有效。

　　3.4创面组织病理学观察

（1）干预后第3天，显微镜下观察实验组与对照组均有红细胞渗出（黄色），实验组较轻，均有炎性反应，以中性粒细胞浸润为主（蓝色），实验组可见成纤维细胞聚集，但分布紊乱，实验组出现新生微血管，对照组成纤维细胞分布较少，炎性细胞多见，新生毛细血管数目稀少。

（2）干预后第7天，实验组炎性反应减轻，可见大量成纤维细胞（黑色）和大量新生微血管，与第3天相比较增加显著；对照组有红细胞渗出，炎性反应较重，可见聚集的巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等炎性细胞，出现少量成纤维细胞及少量微血管。

（3）干预后第14天，两组均可见肉芽组织（绿色），实验组肉芽组织结构致密，更多更密集，对照组仍可见散在炎性细胞浸润，少量成纤维细胞及新生毛细血管。

3.5创面组织中TGF-β1、MMP-2和TIMP-2蛋白的表达

（1）各组大鼠创面组织TGF-β1表达的比较

ELISA结果显示，创面造模后第3、7、14天取材，就指标TGF-β1蛋白来说，实验组数据远大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

（2）各组大鼠创面组织MMP-2含量的比较

创面造模后，第3、7、14天，就MMP-2蛋白指标来说，实验组数据低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

（3）各组大鼠创面组织TIMP-2含量的比较

创面造模后，第3、7、14天，就TIMP-2蛋白指标来说，实验组和对照组的数据均提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

（4）各组大鼠创面组织MMP-2/TIMP-2表达比值的比较

干预后第3、7、14天，就MMP-2/TIMP-2比值来说，实验组数据低于对照组，差异有统计学意义，TGF-β1与MMP-2/TIMP-2比值呈负相关。

　　第四章讨论

　　4.1糖尿病大鼠模型的建立

糖尿病大鼠模型广泛地用于糖尿病及其并发症的基础科学研究中。常用的糖尿病大鼠模型有肥胖自发型糖尿病模型、非肥胖自发型糖尿病模型、单纯高脂和（或）高糖饮食建立大鼠糖尿病模型，还有STZ注射建立糖尿病大鼠模型，还有高脂和（或）高糖饮食联合STZ注射糖尿病模型，还有转基因或基因敲除糖尿病模型等。其中单纯STZ注射，以及高脂高糖联合STZ注射这两种方法被选用、应用地相对较多。前者是利用STZ作为一种氨基葡萄糖的亚硝脲衍生物，可直接破坏胰腺β细胞，导致胰岛素分泌显著降低，此法诱导出的更接近于1型糖尿病大鼠模型，但其死亡率较高[34]。后者是先通过高脂高糖饮食诱发大鼠产生胰岛素抵抗，再通过小剂量注射STZ降低胰岛素分泌，最终导致高血糖血症，这种方法模拟了2型糖尿病的发病过程[34]，因此更接近于2型糖尿病大鼠模型，且此法成模率高、死亡率低。因此目前，高脂和（或）高糖饮食＋STZ注射诱导糖尿病模型是运用最为广泛的一种。张玉领[35]发现，饲养大鼠高脂、高糖的食物，大鼠体重明显增加，并且出现胰岛素抵抗现象。再对大鼠进行腹腔注射STZ，剂量按照30mg/kg计算。2型糖尿病动物模型构建成功。实验选用的大鼠性别为雄性，因为雄性对STZ更敏感，模型更容易构建成功。学者Mizutani认为当大鼠任一时刻的血糖水平≥16.7mmol/L时，则该大鼠的糖尿病模型制作成功。[36]。对大鼠的血糖水平测定采用尾静脉采血法、以及用血糖仪测出。本实验选用健康SD大鼠，性别为雄性，用高脂、高糖食物饲养，历时4周，再对大鼠进行腹腔注射STZ，剂量按照30mg/kg计算，STZ溶液浓度为1%。在三天后测定大鼠的血糖水平，若血糖≥16.7mmol/L时造模成功；否则视为不成功，再次空腹12小时后，以1%STZ溶液（10mg/kg）腹腔注射再次诱导，如仍不成功则剔除实验。共计喂养SD大鼠20只，但因中途死亡3只及未成模2只，最终实验组大鼠剩下15只。

　　4.2糖尿病溃疡模型的建立

糖尿病溃疡模型常用于糖尿病溃疡的发病机制及其疗法的疗效评价等研究中。目前，常见的建模方法按其建立原理分为两大类，即模拟病理因素和模拟临床病征[37]。前者又分别通过结扎血管或压迫皮肤、分离坐骨神经和感染金葡菌等[37]具体方法，从局部缺血、周围神经病变和糖尿病易感染性的糖尿病溃疡的发病诱因的层面去模拟糖尿病的发病过程，从而建立糖尿病溃疡模型。后者指采用一些手段，包括切除全层皮肤、环形夹板和烫伤等组织破坏的方法直接建立溃疡创面，以模拟糖尿病溃疡的外在状态，而非自发形成的溃疡[37]。糖尿病足溃疡发病机制复杂，因此单独模拟某一个病理因素而建立的模型与临床上遇到的糖尿病溃疡不甚相同，未能同时模拟多种机制，因而模型欠稳定，也缺乏代表性。而单独模拟临床病征则只是通过物理方法导致创面延迟愈合，而不是真正形成难愈性创面，同样存在局限性。因此，采用模拟多因素建立糖尿病溃疡模型或模拟病理因素＋组织破坏建立糖尿病溃疡模型是相对理想的途径，这样的模型在机制和症状等方面更接近临床病患，也更具有研究价值。Lee等[38]采用全层皮肤切除＋伤口处感染MRSA的方法，成功建立糖尿病感染性溃疡的模型，并延缓溃疡创面的愈合速度。本实验采用同样的方法，即先在糖尿病大鼠的背部构建全层皮肤缺损，再往创面滴入1ml金葡菌菌液（6×1012/L）进行糖尿病溃疡模型的建立。术后大概第3天，各大鼠创面皮肤颜色晦暗，创面及周围有红肿、皮温升高，创面可见组织坏死，或脓性分泌物，或坏死黑痴，用大头针刺创面5mm无出血，即表示溃疡模型成立。

　　4.3同种异体PRP与自体PRP的区别

按照血液来源分类，富血小板血浆（PRP）可以分为两类，一类为同种异体富血小板血浆（allogeneicplatelet-richplasma，al-PRP），另一类为自体富血小板血浆（autologousplatelet-richplasma，au-PRP）。自体PRP顾名思义，即完全来源于个体自身外周血，因此在用药时不会发生排斥反应，没有感染转染性疾病的风险。PRP具有制备简单及价格低廉等优点[39]。但由于个体间差异的存在，取自不同个体的血小板数可能存在较大差异，因而会对制备得的PRP生物性能产生影响；再者，每个患病机体所遭受的急性或慢性损伤打击不同，他们所处的基础状态也不完全一致，就糖尿病患者而言，其血液中存在大量糖基化终末产物，大动脉及末梢血管内血流动力学变化，血液的凝固性增加，同时感染风险也较正常人血液要高，甚至还可能合并多脏器功能不全，因此不适宜采取他们的自身外周血制备PRP[40]。相较于自体PRP而言，同种异体PRP常来源于健康的正常机体，其中的血小板含量更稳定，实验结果误差较小，同时规避了对患病机体的再次侵扰，因此对同种异体PRP的研究与应用颇具现实意义。本实验通过建立糖尿病大鼠合并皮肤溃疡创面的模型，观察到局部外用同种异体PRP能够促进糖尿病创面的愈合，与对照组相比，治疗组在相同时相点的创面愈合率要明显提高，愈合速度加快，同时也可预见愈合时间显著减少，与文献研究的结果相同。但想进一步论证同种异体PRP的疗效是否优越于自体PRP尚需后期设立对照组、进行大样本量的基础或临床研究。

　　4.4富血小板血浆在创面愈合中的作用

随着基础研究的深入，各种生物细胞因子在创面愈合中发挥的重要作用逐渐被人们所认识。整个溃疡创面修复过程，多种细胞因子，在创面愈合中起到了重要的作用，其中主要包括以TNF、IL-1为代表的抑制破坏型因子和以VEGF、TGF-β为代表的正向调节型细胞因子[41]。Papanas等研究结果示，血管内皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、转化生长因子β等多种细胞因子都有促进糖尿病溃疡愈合的效果[42]。但在糖尿病溃疡创面，这些生长因子调控系统发生障碍，含量大幅降低或者比例失控，导致失去原有的功能，创面愈合缓慢。[43]。富血小板血浆，也就是PRP。它的主要成分是血小板，血小板在进入患者体内后，被凝血酶-钙剂激活，刺激机体产生多种生长因子。像血小板源性生长因子（Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF），还有血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），还有转化生长因子（Transforminggrowthfactor，TGF）、表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor，EGF），以及胰岛素样生长因子-1（Insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）等。PDGF有多种功能。一：刺激机体生成纤维蛋白，以及透明质酸。二：调节细胞外基质的含量。三：加速成纤维细胞分裂。四：提高胶原蛋白含量[44]。PDGF还与TGF-β在创面愈合过程中协调发挥作用。另外，PDGF在创面愈合的炎症期、上皮化阶段和重塑期均发挥作用[44-45]。VEGF能够改善血管通透性，还能重建血管，是一种血管活化因子。[46]。TGF包括TGF-α和TGF-β两大类，TGF-α能够刺激角质形成细胞和成纤维细胞的增殖，还能促进血管的生成[39]；TGF-β则广泛地参与创面愈合的各个阶段，发挥重要作用，但其在糖尿病溃疡创面中的作用还不甚明确，尚需进一步的研究。EGF能够刺激伤处上皮细胞的生长，增强修复早期上皮化过程，从而促进糖尿病溃疡创面的愈合[47]。IGF-1能够调节细胞增殖与分化，促进糖原、胶原的合成[39]。当PRP被应用于糖尿病溃疡的治疗时，这些生长因子被释放到创面，通过协同作用直接参与溃疡的修复，促进创面愈合。

除却必要的生长因子协同作用外，细胞外基质的合成与降解是创面愈合过程中另一重要的环节。MMPs是一种蛋白水解酶，它需要在锌存在的条件下才能发挥功能。它能分解各类细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）。按作用底物的不同，MMPs可以分为6类，其中最重要的是胶原酶和明胶酶。TIMPs是MMPs的特异性抑制剂，能通过调控基因转录、生成非活性酶原以及与活性酶结合形成MMP/TIMP复合物的方式，在这三个水平上对组织中MMPs的含量和活性进行调节[48]。在创面愈合过程中，MMPs发挥水解作用清除受损的ECM成分，促使新生成的蛋白分子落于原来相应的位置，还能介导组织重塑。但在某些病理状态下，如糖尿病继发性皮损，局部病损长期刺激、末梢血运不畅、营养不良及易滋生细菌感染等多重因素的作用下，创面组织中长期含有大量炎性细胞，这些炎性细胞分泌MMPs。这些MMPs就是导致创面难以愈合的主要原因之一。这些MMPs能够水解多种有益因子，像生长因子，还有细胞因子，还有细胞受体，以及细胞外基质。这些有益因子的减少导致创面愈合缓慢，甚至难以愈合。张东萍等[49]研究表明，TIMPs是MMPs的抑制因子。在糖尿病患者的创面组织中，MMPs处于高表达状态，而TIMPs则处于低表达状态。基质金属蛋白酶-2（MMP-2），和MMP-9一样都是明胶酶，它们能降解多种成分，有明胶，还有IV/V胶原蛋白，还有弹性蛋白，以及变性胶原明胶等，[50]。MMP-2有四大重要功能。一：调控ECM。二：参与血管重建。三：促进肉芽组织的生长。四：参与组织重建。TIMP-2是MMP-2的内源性抑制剂，对MMP-2有直接抑制作用。当MMP-2在组织中表达时，TIMP-2也随之表达出来，抑制MMP-2的表达与活性，防止其过度的破坏作用，而且该诱导过程很少受其他细胞因子影响。此外，TIMP-2也可直接参与调节细胞增生及新生血管形成等[50]。多项研究证明，TIMP-2能抑制ECM蛋白的水解。然而TIMP-2过度表达，一旦打破MMP-2与TIMP-2之间的平衡，则会导致ECM的病理积聚，导致伤口挛缩，即Dupuytren挛缩症[51]。由此可见，MMP-2/TIMP-2的平衡在伤口愈合及转归中起重要作用。Lobmann等[26]发现，糖尿病溃疡患者创面组织中MMPs，以及TIMPs含量不同于正常人，相较于正常人，MMP-1，还有proMMP-2，还有MMP-2、以及MMP-9都升高，而TIMP-2含量下降。由此推测，糖尿病创面内MMP-2生成过多，TIMP-2分泌不足，MMP-2/TIMP-2表达的失衡是导致糖尿病创面愈合障碍的原因。前面已提到PRP治疗糖尿病溃疡能够直接提供创面修复所需要的生长因子，此外，研究显示，当PRP被应用于糖尿病创面后，创面组织中MMPs表达下降，而TIMPs表达升高，MMP/TIMP的比值（包括MMP-9/TIMP-1及本研究涉及的MMP-2/TIMP-2）相较治疗前、空白对照组均有了改善，提示PRP对糖尿病创面的促愈机制可能与改善了MMP/TIMP的平衡有关。但这其中的具体作用机制仍不是很明确。TGF-β被认为可能与之有关。TGF-β作为目前研究热点之一，受到了科研人员的重视。TGF-β分三种，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1由于其具有促进基质合成及成纤维细胞生长的作用，在溃疡创面修复中扮演了非常重要的角色。富血小板血浆（PRP）是近些年来应用于创面治疗的新方法，其原理在于血小板活化后可产生多种细胞因子，促进组织新生，同时具有抑菌、纤维蛋白填充创面缺损等作用，因而能促进创面愈合。其中，TGF-β1是富血小板血浆活化后分泌的一大类细胞因子。Zhang等研究示，TGF-β1能促进胶原形成、促进组织愈合[52]。另有研究证实TGF-β1具有促使巨噬细胞及成纤维细胞趋化至创伤部位的作用，从而促进创面愈合[53]。基础研究结果证明，TGF-β1能参与炎症反应、血管生成、胶原沉积等多个环节，多维度地促进溃疡组织愈合[54]。有研究提示，TGF-β1可能通过调节MMP-2／TIMP-2的相对表达水平来参与基质的合成和降解，具有正向的调控作用。但关于此方面的基础研究甚少。在李兰等人的初步临床研究中，除了观察到MMP-2和TIMP-2表达的变化外，还注意到创面局部TGF-β1浓度在经PRP治疗后增加了2-3倍[55]，提示TGF-β1可能参与调节了MMP-2和TIMP-2表达的变化。后续研究中，李兰等[33]又检测了经PRP治疗前后糖尿病创面肉芽组织，监测MMP-2，还有TIMP-2，以及TGF-β1的含量变化曲线，从曲线得出，用PRP治疗，创面组织内的MMP-2含量降低，TIMP-2表达增加，TGF-β1表达与TIMP-2呈正相关、与MMP-2/TIMP-2呈负相关，进一步提示了TGF-β可能与这些效应相关。然而，在另外一些研究中，PRP或其他PDWHFs对MMP-2和TIMP-2表达影响的结果却不相同，Ho等[29]发现富血小板血浆PRP能够促进OLETF模型小鼠高表达MMP-2、MMP-9。

基于此，实验采用先喂养大鼠高脂高糖食物，再STZ注射的方法建立大鼠疾病模型。再以此为基础建立大鼠溃疡模型，通过观察不同时间点的大鼠创面组织修复情况及检测组织中TGF-β1、MMP-2、TIMP-2的表达，从分子生物学的角度去探讨在富血小板血浆糖尿病大鼠创面愈合中的作用。创面愈合情况结果显示，与对照组相比，实验组糖尿病大鼠溃疡创面的愈合率明显增加，愈合速度明显加快，同时也可预见溃疡创面愈合时间明显缩短；组织细胞形态学显示，与对照组相比，实验组在同一治疗时间下，大鼠的创面组织中的各类结构细胞含量增多。例如，成纤维细胞分裂明显，纤维组织数量变多。同时，创面中的新生血管更多，炎性细胞数量更少。在治疗期间的第3、7、14天的时间段，取创面组织进行ELISA分析。结果显示：实验组的MMP-2水平低于对照组（P＜0.05），TGF-β1、TIMP-2含量高于对照组（P﹤0.05）。

通过这次实验验证，PRP技术可以治愈糖尿病足溃疡，增加溃疡组织中的TGF-β1、TIMP-2的含量，降低MMP-2的含量，加速创面的恢复。同时在动物实验层面证实，TGF-β1发挥组织修复的作用可能与调节MMP-2／TIMP-2有关。据此我们认为在富血小板血浆治疗糖尿病大鼠溃疡创面的过程中，富血小板血浆可能通过调控TGF-β1—MMP-2/TIMP-2浓度变化，增加溃疡组织中的修复细胞数量，抑制溃疡组织的炎症反应。

　　4.4不足

本研究也存在以下方面的不足：虽然现有研究表明TGF-β1与MMP-2/TIMP-2呈正相关，且在我们的动物实验模型中也验证了这种关系，但本研究尚未能阐明两者之间相互作用的具体机制，在后续的研究中还需要进一步查找TGF-β1和MMP-2/TIMP-2之间可能的作用靶点，探索它们之间的相互作用方式。此外，还有文献有不同的观点，这些研究认为PRP中血小板增加了许多生长因子，但组织的修复并不是这些因子作用的结果。例如：高含量的TGF-β1将刺激micro RNA的高表达，或者其他高含量因子将刺激micro RNA的表达，从而使溃疡修复。这些疑问是将来研究的内容。尽管还有一些疑问，但可以确定的是，PRP可以提高糖尿病溃疡患者的治愈率。为富血小板血浆有效治疗糖尿病溃疡病变提供了基础数据支持，提示富血小板血浆作为一个有价值和前景的治疗手段可能为难愈性创面的治疗提供新的思路和策略。另外，本次实验只运用了进行了动物实验，未能进行临床部分的试验，对于是否能有效性地应用于临床治疗未能给出答复，因此仍待进一步探讨。

　　4.5后续研究

后期我们将补上临床试验部分，更直接地观察富血小板血浆（PRP）应用于临床糖尿病溃疡病患的疗效，同时，也会对动物实验部分的设计进行改进，如扩大样本量、增加观察时间点及增加某些指标的测定等，以期更完整地阐述PRP治疗糖尿病溃疡的效果及潜在机制。未来我们还将进一步研究及探讨TGF-β1与MMP-2/TIMP-2之间的可能作用方式，当然，也会从其他可能机制的角度进一步研究PRP的促愈机制，而不只是着眼于MMPs/TIMPs的研究。

　　第五章结论

本研究选取健康雄性SD大鼠作为研究对象，通过制作全层皮肤缺损＋感染金葡菌的方法在大鼠身上建立糖尿病溃疡模型，在模型中观察、比较了PRP对创面愈合的影响，并对其中的机制做了一些探讨，主要得出以下结论：

1.利用制作全层皮肤缺损＋滴入金葡菌菌液的方法可以成功地制造糖尿病皮肤溃疡模型。

2.富血小板血浆治疗糖尿病大鼠溃疡创面，能促进溃疡组织新生血管形成、成纤维细胞增殖，提高溃疡创面愈合率，加快愈合速度，愈合时间可预见地明显缩短。

3.富血小板血浆促进糖尿病大鼠溃疡愈合的机制可能与TGF-β1活化表达水平增加，在抑制MMP-2同时促成TIMP-2，通过调节MMP-2／TIMP-2的相对表达水平来调节基质的合成和降解，进而促进组织愈合有关。

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