抗丙型肝炎病毒的酶抑制剂型药物的研究进展

　摘要

丙型肝炎是由丙肝病毒(HCV)感染且是肝硬化和肝细胞癌的主要原因之一，随着HCV病毒的适应进化感染出现了慢性丙肝患者，传统治疗方案面临淘汰。HCV病毒感染者又分为不同的基因型患者，直接抗病毒药物（DAAs）出现后，人们开始对不同基因型的HCV感染患者进行DAAs药物的联合使用，使所有类型的HCV感染患者看到曙光。基本的治疗方法都是采用不同的直接抗病毒药物进行联用治疗不同类型的HCV患者。直接抗HCV病毒的酶抑制剂有三种，分别是：（1）NS3/4A蛋白酶抑制剂，其机制是NS3/4A蛋白酶抑制剂与NS3/4A蛋白酶的活性中心发生可逆的共价结合与可逆非共价结合，竞争抑制NS3/4A蛋白催化裂解位点，使HCV多聚蛋白前体不能催化等来阻断HCV病毒各个需要丝氨酸蛋白酶的环节，NS3/4A蛋白酶抑制剂还具有提高自身固有免疫的功能因为它可以恢复已经感染细胞的I型干扰素信号通路；（2）NS5A抑制剂，没有酶催化活性位点，但能参与HCV病毒生长周期的多个阶段，并可以结合其他抗病毒药物一起抑制HCV翻译和复制，表现出功能的多样性，是研究的热点；（3）NS5B聚合酶抑制剂，是病毒中一种RNA依赖性RNA聚合酶，以病毒RNA链为模板催化核糖核苷三磷酸合成HCVRNA。所以它可以直接抑制HCV病毒RNA合成并破坏病毒复制周期。NS5B聚合酶抑制剂又分为两类，一类是核苷类NS5B聚合酶抑制剂，模拟酶的天然底物与催化活性位点竞争插入到新合成的核苷酸链来终止链的延伸来阻止HCV的生命周期。另一类是非核苷类NS5B聚合酶抑制剂与NS5B催化变构位点结合使HCV复制的复合体的构象发生改变，让病毒不能与之结合从而干扰病毒复制周期。混合感染患者及孕妇等特殊人群。DAAs虽然是目前的主流治疗方案，但在临床上也存在局限性，需要针对不同的患者进行不同方案的治疗。

　关键词：丙型肝炎病毒；酶抑制剂；直接抗病毒药物；NS3/4A蛋白酶抑制剂；NS5A抑制剂

引言

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的肝脏疾病，主要通过血液和血液制品，性接触和母婴传播。世界卫生组织在2016年公开发布世界上大约有7100万人感染HCV，大概30%的HCV感染者在6个月内可以恢复健康，将近70%的患者经受HCV病毒感染演化为一种难治之症，称为慢性丙型肝炎（CHC）。在CHC患者中大概15%~30%的患者在20年内会发展为肝硬化之后变成肝癌。肝癌发生的死亡率占据全球癌症系谱第三名，同样也是我国频繁发生的恶性肿瘤疾病之一，据2019年统计在我国丙肝病毒感染者约1000万人。HCV病毒是直径约55至65nm的小球形核糖核酸（RNA）病毒，属于Flavivir家族的肝病毒，外膜是具有超微结构的脂质包膜。HCV病毒的生命周期包含四个过程：吸附与融合、RNA复制和翻译、蛋白质组装、病毒的出芽和释放。就目前从遗传学角度来分，根据HCV病毒的基因组被分成7个基因型、67个亚型。在中国丙肝患者基因1b型急剧下降，但基因型3和6型在某些特定地区和群众中盛行，明确HCV基因型的分布有着很重要的作用。抗病毒治疗的药物可分为广谱性药物和靶向药物，靶向治疗又分为靶向基因治疗、靶向蛋白治疗、靶向酶治疗。随着酶抑制剂的大量开发，酶抑制剂药物占据抗病毒治疗市场的“有力军”。治疗丙型肝炎的传统方案是聚乙二醇干扰素（PEG-IFN）和广谱抗病毒药利巴韦林（RBV）的联合治疗。其作用机制是通过调节免疫系统和细胞抗病毒作用来破坏病毒复制的环境。它是一种功能强大的工具，可广泛应用于临床。因为这种方法没有针对性，治疗周期长，只有不到50%的患者可以治愈。判断患者是否被治愈是根据持续病毒学应答（SVR）：按照治疗方案12周或24周后，血液中未检测出HCVRNA，测出SVR率＞90%则表示被治愈。随着CHC病人的出现，传统治疗方法已不适用，积极的是，随着直接抗病毒药物(DAAs)高速发展，其主要作用于丙肝病毒自身复制所需的蛋白酶和多聚酶，针对参与丙肝生命周期关键步骤的三种蛋白有NS3/4A丝氨酸蛋白酶、NS5A蛋白和依赖RNA的RNA聚合酶NS5B蛋白，使用DAAs直接作用于HCV病毒蛋白。因其具有高SVR率且疗效高、使用便利、药物耐受性好、作用时间短、临床治愈率高等优势，正因为它具有更好的安全性和有效性而被大范围的实践在临床。随着DAAs的广泛使用许多制药企业积极投入生产研制DAAs药物，因此抗丙型肝炎病毒的治疗进入了口服治疗的时代就是“DAAs时代”，也是抗病毒治疗史上的里程碑。现代医学的治疗方案是联合不同的DAAs药物联用就是依靠使用不同DAAs家族的不同小分子靶向病毒复制的步骤不同来降低病毒的发生率和药物之间的毒性及其增强疗效，为现在治疗HCV的方案，值得推广应用。但DAAs也存在着许多问题如药物间相互作用、药物价格昂贵等，在没有疫苗的情况下，以筛查预防为主来治疗。

1治疗HCV的酶抑制剂型药物

　　1.1NS3/4A蛋白酶抑制剂药物宿主宿主

抗丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A蛋白酶抑制剂有良好的前景，现已成为开发抗-HCV治疗热点的药物靶点。在含有NS3-Q41R的蛋白酶中，MAVS的N端裂解产物对活性位点保持高亲和力，使蛋白酶对潜在的产物抑制敏感。研究发现在病毒复制和免疫逃逸过程中蛋白酶-肽存在相互作用的微妙平衡，这可能限制了蛋白酶的适应能力，并缩小了病毒的进化空间。开发新型的NS3/4A大环抑制剂GP205，在血浆和肝脏均有良好的药物治疗且半衰期长。其下药物批准上市的与联合其他DAAs药物使用的药物有：丹诺瑞韦、格佐匹韦、格拉瑞韦、凡尼普韦、西咪匹伟、维曲瑞韦、博赛普韦、阿舒瑞韦。

（1）丹诺瑞韦

中国在2018年6月8日批准了一种抗HCV的NS3/4A蛋白酶抑制剂丹诺瑞韦并与利托那韦联合治疗丙型肝炎病毒(GT)1b型感染患者。歌礼公司把规格为100mg达诺瑞韦与100mg利托那韦制成片剂，剂量为一次1片，早晚进行2次服用。

（2）格佐匹韦

格佐匹韦与艾尔巴韦(GZR/EBR)联用与利巴韦林治疗12周，95.2%的患者获得了高持续病毒学应答。其剂量为50mg艾尔巴韦和100mg格佐瑞韦制成片剂，一天一次，一次一片在进行治疗1b型HCV感染的血液透析患者是非常有效和安全。

（3）格拉瑞韦

对于一些合并疾病的患者，格拉瑞韦的特有特点给这些患者带来了福音，特别是像晚期CKD或感染HCV前没有使用含其他DAAs药物治疗的患者。对于所有HCV基因型都表现出强大的抗病毒活性的患者来说，正是由于格拉瑞韦的特点，所以采用格拉瑞韦与哌仑他韦联用，其规格为100mg格卡瑞韦和40mg哌仑他韦制成片剂一天三次一次1片，99%接受这种方案的患者在治疗12周时获得了持续病毒学应答。对于达卡他韦和阿舒瑞韦联用治疗无效的患者，格拉瑞韦和哌仑他韦联用成功再治疗。该药物方案还存在于对于有以往治疗或没有进行治疗的慢性HCV基因1、2、4、5或6型感染和代偿性肝硬化患者中具有良好的安全性。

（4）凡尼普韦

是一种大环非结构的NS3/4A蛋白酶抑制剂，凡尼普韦+ribavirin（PR）进行治疗24周表现持续病毒学应答，是一种有效、耐受性良好的治疗方法，适用于以往干扰素治疗失败的丙型肝炎病毒1型的感染患者。

（5）西咪匹伟

西咪匹伟治疗基因1型HCV感染者以及代偿性肝脏患者，西咪匹伟+聚乙二醇干扰素/利巴韦林治疗基因4型患者失败后出现的突变与基因1型患者相似，并对西咪匹伟产生高水平耐药性。

（6）维曲瑞韦

与其他DAAs联合在不降低治疗成功率的情况下，在缩短治疗时间方面非常有效。必须与其他DAAs联合才能实现持续的病毒应答。

（7）博赛普韦

现在一般对聚乙二醇干扰素/利巴韦林联合治疗的未治愈的HCV-1型/HBV双感染患者，在进行博赛普韦联合聚乙二醇干扰素/利巴韦林的治疗方案，这是非常有效的[28]。临床结果表明，该方案可在一定程度上作为丙型肝炎治疗的标准方案，并能显著地提高丙型肝炎患者的持续病毒学应答。

（8）阿舒瑞韦

从贺曼双重试验中得出丙型肝炎病毒GT-1b感染患者用阿舒瑞韦与达卡他韦的方案，使得病毒活性具有高抗性，ASV+DCV的全口服双重治疗可使亚洲HCV感染基因型1b的患者SVR率高。

　1.2NS5A抑制剂

NS5A是一种对称结构的抑制剂虽然无酶催化活性且与其他抗病毒药物作用的靶点不同，但是HCV病毒的复制过程需要NS5A蛋白，该蛋白与其他细胞蛋白一起抑制NS5A的高度磷酸化从而达到阻止HCV的复制与装配过程来降低患者的病毒量同时显示出较好的病毒耐受性。临床研究证明NS5A抑制剂具有增强其他DAA药物作用方案清除HCV的过程。NS5A容易发生突变体现出功能的重要性和多样性，在探索NS5A抑制剂的HCV抑制模型上不支持针对NS5A抑制剂的有效的蛋白水平上进行筛选的方法，需开发抗耐药性高的新型酶抑制剂是科学家今后研究的方向。对于今后研制出更有效的NS5A抑制剂治疗HCV患者的药物或与其他抗病毒药物联用有重要的意义，当然也为探索蛋白-蛋白之间的作用提供新路径，为类似作用机制的药物的研究治疗其他疾病提供一定的参考。第二代NS5A抑制剂成为当下治疗丙肝方案的热点酶抑制剂抗病毒药物。目前上市与其他抗病毒药物治疗HCV的药物有：达卡他韦、艾尔巴韦、维帕他韦、雷迪帕韦。

（1）达卡他韦

是NS5A第一种高效的复制复合物抑制剂，达卡他韦是通过先导化合物的高强度反复筛选和修饰得到的。在实验过程中，达卡他韦对HCV病毒的RNA有明显的抑制作用。在HCV病毒的基因型1的临床治疗联用达卡他韦和干扰素/利巴韦林，最后结果高达持续病毒学应答80%。

（2）艾尔巴韦

2016年NS5A抑制剂艾尔巴韦在日本PMDA批准上市，并与NS3/4A蛋白酶抑制剂联用治疗HCV基因1型感染患者或者改善C型代偿性肝硬化导致的病毒血症，其用法为50mg艾尔巴韦和100mg格佐瑞韦制成片剂，一天一次，一次一片。

（3）维帕他韦

强效的泛基因型丙型肝炎病毒NS5A抑制剂Velpatasvir(VEL)的发现是唯一获批的治疗HCV感染的泛基因型单片治疗方案(STRs)的组成部分。将泛基因型丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂voxilaprevir添加到SOF/VEL是STR，它为HCV病毒基因1-6型HCV患者提供了97%的治愈率，也能治愈曾有过另一种治疗失败的经历治疗方案。

（4）雷迪帕韦

2014年FDA批准雷迪帕韦+索菲布韦（Sofosbuvir）联用主要用于治疗基因1型HCV感染，其剂量为90mg的雷迪帕韦与400mg的索菲布韦制成片剂一天一次，一次一片。也有研究表明有患者曾经接收过NS5A抑制剂类抑制剂的治疗且失败后，对这种患者再行雷迪帕韦+索菲布韦联合治疗具有可行性。

　1.3NS5B聚合酶抑制剂

NS5B聚合酶是一种在HCV和病毒复制所必需的酶，它催化核糖核苷三磷酸（rNTP）与来自HCV病毒的RNA正链的聚合作为复制模板，是HCV病毒复制过程中的关键限速酶。NS5B聚合酶抑制剂有两类，一类是核苷类NS5B聚合酶抑制剂，HCV不仅耐药性高不易突变还抗病毒范围广，对不同基因型的HCV患者有选择活性治疗。另一类是非核苷类NS5B聚合酶抑制剂，耐药性与核苷类抑制剂相反且作用于变构位点，同样也具有选择活性，该抑制剂则需与其他抗病毒药物进行联合使用。总之，现在市场上的各大制药公司以NS5B聚合酶抑制剂为抗HCV药物开发研制的关键靶点。

　1.3.1核苷类NS5B聚合酶抑制剂宿主宿主

核苷类剂NS5B聚合酶抑制剂的作用机制是模仿NS5B聚合酶的天然底物，与细胞内核苷酸磷酸竞争形成催化活性位点，使模拟的底物合成到新的RNA链，破坏病毒的延伸。2013年，FDA批准上市吉利德公司研发的首个NS5B聚合酶抑制剂药物索菲布韦，使HCV的治疗取得了突破性进展。索菲布韦（Sofosbuvir，SOF）是DAAs家族中唯一一个全口服治疗丙型肝炎的酶抑制剂药物并且不需要与干扰素联用就可治疗HCV患者。SOF联合药物治疗范围广泛，是当下直接抗病毒药物研究热点药物，是抗病毒药物史上的巨大飞跃。SOF不仅使细胞色素P450同工酶代谢不成功，而且也不诱导或抑制作为这些酶底物的抑制剂的代谢，在临床对HCV病毒表现出高耐药性并且患者的接受度好，SVR在70%至90%之间变化。并且SOF也可以安全地用于血液透析患者。

索菲布韦+NS5A抑制剂对HCV基因型2的感染者达到较高的持续性应答和对肝内纤维化的改善。用索菲布韦与维帕他韦联合利巴韦林治疗CHC患者不仅治疗效果好，还表现出强大的抗病毒水准。所以推荐索菲布韦(SOF)和达卡他韦(DCV)治疗所有HCV患者的各种基因型。该方案比SOF+RBV方案有更高的SVR率。在非结构蛋白NS5A抑制剂受限的情况下，SOF+RBV方案仍可用于治疗HCV感染，特别是非肝硬化患者。无论是什么基因型患者或具有肝硬化患者，SVR12总发生率总是大于90%。因为该药物是X吉利德公司研发，价格昂贵且无专利引进，使我国丙肝患者悲喜相交，所以我国许多生物制药公司开始对安全高、抗病毒效率高且价格实惠的索菲布韦仿制药进行研制申报，使得我国丙肝患者尽早得到经济高效的治疗。

1.3.2非核苷类NS5B聚合酶抑制剂宿主

非核苷类NS5B聚合酶抑制剂酶活性低都是通过改变NS5B结构域的空间构象来提高NS5B聚合酶活性，因此对HCV患者的基因型有选择性并且耐药活性低，所以通常需要与其他靶点的直接抗病毒药物联用。主要市面上的药物研发为艾伯维公司的达沙布韦（dasabuvir）。达沙布韦（Dasabuvir）：奥比他韦（ombitasvir）+达沙布韦治疗丙型肝炎病毒(HCV)基因型1b感染8周或12周的患者显示出高疗效，当然OBV/DSV也可用于治疗基因型1b感染治疗初治患者轻中度纤维化，在现实生活中具有良好的疗效和安全性。达沙布韦的剂量为250mg制成片剂1天2次一次1片，它的发现是抗病毒酶抑制剂的一个药物研发进步，但存在局限性，如低基因型覆盖率和一些技术局限的问题。

　1.4DAAs局限性

随着全球根除丙型肝炎病毒(HCV)的努力，DAAs开启了全球酶抑制剂抗病毒时代，但同样DAAs存在着许多局限性问题，比如抗病毒药物抑制剂的药物相互作用、特殊人群的使用比如孕妇、儿童。对孕妇的治疗能有意义的减少母婴传播，临床表明用DAAs治疗妊娠期是有初步的效果而且疗程相对短，还有哺乳期乳汁也能感染，则对妊娠期和哺乳期的治疗有迫切需求，实现HCV特殊人群的治疗目标，目前妊娠期治疗正成为研究的热点。目前对于DAAs治疗的缺点有一个新突破口，就是靶向新靶点的抑制剂可使SVR达到100％目标，使得HCV治疗取得突破性进展。

2结果与讨论

　　2.1结果

在DDAs药物快速更新迭代的时代，目前治疗上市的4种治疗方案为NS3/4A+NS5A+NS5B（非核苷类）；NS3/4A+NS5B（核苷类）；NS5A+NS5B（核苷类）；NS3/4A+NS5A。可能上市的2种NS3/4A+NS5A+NS5B（核苷类+非核苷）；NS3/4A+NS5A+NS5B（核苷类）。随着丙型肝炎得到重视和CHC患者的出现，许多制药公司开始大力开发研究，在2014年和2016年DAAs药物上市种类多，其次是2011年、2013年都有研制开发出两种，2015年和2018年都上市了一种。

在日本PMDA上市的占比大且达到46.1%；其次是X上市占比达38.5%；中国和欧洲EMA上市占比都为7.69%。X研制DAAs药物起步早，研发上市数量也多，X在治疗HCV患者也具有多种选择方案；日本在2014年和2016年着力开发上市DAAs药物，可知在这两年间日本丙型肝炎的治疗得到大力研发和支持；中国则起步晚、进展慢可能与群众接受度低有关。

　　2.2讨论

选择最佳治疗方案：第一阶段，治疗前开展筛查工作，针对患者所感染的HCV病毒进行基因检测和分型；第二阶段，根据筛查结果对慢性丙型肝炎患者制定个性化治疗方案，包括治疗开始时间、治疗周期、治疗药物的选配、特殊人群HCV感染患者的治疗方案特殊选择等；第三阶段，治疗过程中，密切关注DAAs与其他酶抑制剂药物之间的相互作用所造成的副作用及其对DAAs药效活性的抑制。第四阶段，对治疗结束后的患者，进行定期回访，及时检测有无复发。国外DAAs药物研发快，尤其吉利德公司的抑制剂研发迅速处于前列。在我国DAAs药物专利不够，国外进口又贵，蛋白酶抑制剂研发可能不够满足当代的HCV患者的需求。希望我国早日发明出平替药物与研制出疫苗，减轻治疗费用。我国也在用本土中药对HCV进行治疗，比如：小柴胡汤有抗HCV作用[55]。或许可以开辟一条新思路，用平价的DAAs药物联合本土的中草药进行联合治疗，发现一种适合本土的治疗方案可以治愈所有类型的HCV患者。

开发方向：宿主靶向药物：靶向药物（HTA）的治疗是高度可治疗的。靶向新靶标的抑制剂，例如HCV蛋白（E1/E2，p7和NS4B）靶标和人类蛋白靶标（例如亲环蛋白A蛋白，细胞周期蛋白G相关激酶和清除剂受体B1）。PROTAC小分子：Protetac靶分子是一种使用protetac的新型药物设计策略，是一种小的双功能分子，它与靶蛋白和E3-panderase结合酶结合，使蛋白酶降解蛋白酶靶蛋白的脯氨酰胺。与一般的小分子抑制剂相比，Protac具有广泛的作用点，可用于靶向无法用作药物的靶标。如果使用量少，则催化量的药物可以产生非常好的药理活性以及高选择性。毒性和副作用如果药物量少而药物量少，则产生目标作用的可能性降低，安全性提高。Protac方法具有在抗病毒特性方面克服由靶蛋白减少引起的对靶蛋白突变的抗性问题的特征。

　参考文献

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